HIF-2琢对自噬介导的肝癌细胞顺铂耐药的影响及机制

目的探究低氧诱导因子-2琢（HIF-2琢）对自噬介导的人肝癌阿霉素耐药细胞株（HepG2/ADM）顺铂（cisplatin）耐药的影响及机制,以期为疾病的临床治疗提供新思路。方法将人肝癌细胞HepG2和HepG2/ADM分为7组并加入相应试剂：（1）HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组;（2）HIF-2琢-siRNA组;（3）NC-siRNA组;（4）3-甲基腺嘌呤（3-MA）＋cisplatin组;（5）cisplatin组;（6）3-MA组;（7）对照组。采用Westernblot法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin1、HIF-2琢蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率,CCK-8试剂盒检测细胞增殖抑制率。结果cisplatin组HepG2、HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、HIF-2α蛋白表达水平及细胞凋亡率较对照组均显著升高（均P＜0.05）。3-MA组HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较对照组均显著下降（均P＜0.05）。3-MA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组、3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）;cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA组HepG2/ADM细胞中HIF-2琢、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较NC-siRNA组均显著下降（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较HIF-2琢-siRNA组、NC-siRNA组和cisplatin组均显著升高（均P＜0.05）;HIF-2琢-siRNA组和NC-siRNA组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组均显著降低（均P＜0.05）。沉默HIF-2琢表达后,随cisplatin处理浓度增加,HepG2/ADM细胞增殖抑制率升高。结论HIF-2琢可能通过调节自噬影响肝癌细胞HepG2/ADM的cisplatin耐药性,因此临床上可通过降低HIF-2α表达水平,提高cisplatin对肝癌细胞HepG2/ADM的杀伤作用,为晚期肝癌治疗提供新思路。     

内质网应激-自噬反应在顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞死亡中的作用

目的研究内质网应激-自噬反应在顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞死亡中的作用,以及自噬基因Beclin 1对HeLa细胞顺铂敏感性的影响。方法不同浓度顺铂作用HeLa细胞后,丹磺酰戊二胺染色法观察细胞中自噬体的形成,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin 1和LC3的表达及内质网应激相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的表达。将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1转染HeLa细胞,Western blot检测Beclin 1在HeLa细胞中的蛋白表达,噻唑蓝比色(MTT)法检测顺铂对HeLa细胞半数抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。结果顺铂作用HeLa细胞后,细胞内自噬体形成增加,自噬蛋白Beclin 1和LC3表达增加,且均呈现时间依赖性(P<0.05),内质网应激相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的表达增强。pcDNA3.1(+)-Beclin1转染HeLa后,Beclin 1蛋白表达增加(P<0.05);MTT检测IC50由转染前的1.0μg/ml下降到0.5μg/ml;凋亡细胞百分率升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论内质网应激-自噬反应参与了顺铂对宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性作用,自噬基因Beclin 1过表达能够增加HeLa细胞对顺铂的敏感性。     

高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制

目的：探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)对宫颈癌细胞化学治疗敏感性 的影响及其机制。方法：采用Western印迹法检测宫颈癌细胞HeLa和CaSki经不同药物浓度顺铂处理后LC3, Beclin1及P62的表达水平,检测使用自噬抑制剂和/或顺铂处理后宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3,Beclin1及P62 的表达水平;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖水平。构建HeLa-shHMGB1,CaSki- shHMGB1,HeLa-CTR及CaSki-CTR的稳定细胞系。以CCK-8检测上述细胞系顺铂半数抑制浓度(half maximum inhibitory concentration,IC50)水平;Western印迹法检测上述细胞系中HMGB1, LC3,Beclin1及P62的表达水 平。结果：在一定浓度范围内,随着顺铂药物浓度的增加,宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3及Beclin1的表达 增加,P62表达降低。与单用顺铂组相比,顺铂联合自噬抑制剂组细胞存活率更低(P<0.05)。在宫颈癌细胞 中,HMGB1的表达与顺铂药物敏感性有关(P<0.05),与LC3,Beclin1表达呈正相关,与P62表达呈负相关。 结论：HMGB1可能通过调控宫颈癌细胞内自噬的水平,影响其对顺铂的敏感性。铂类药物结合自噬抑制剂可能成为 宫颈癌治疗的新策略。HMGB1可能成为预测化学治疗药物敏感性的分子标志物。     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。     

三七总皂苷对顺铂诱导肾损伤大鼠模型自噬蛋白LC3和Beclin1的影响

目的研究三七总皂苷（PNS）对顺铂诱导肾损伤大鼠肾组织中自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达的影响。方法将36只雄性SD大鼠随机分为空白对照组,顺铂模型组,顺铂 PNS组,在给药24 h后处理动物,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)水平,利用透射电镜观察大鼠肾小管上皮细胞粒体形态及自噬体,通过Western blot检测自噬蛋白LC3和Beclin1蛋白的表达。结果大鼠暴露于顺铂24 h后,与空白对照组比较,顺铂模型组血清Cr、BUN显著升高（P<0.05）,尿NAG水平没有明显变化,电镜观察到自噬体出现,肾组织LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。与顺铂模型组比较,顺铂 PNS组血清Cr明显降低（P<0.05）,LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论PNS可能通过提高Beclin1的表达,增强肾组织的自噬而降低顺铂诱导的大鼠肾损害。      

白细胞介素6通过抑制自噬促进人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨IL-6对血管内皮细胞自噬和凋亡的影响以及自噬与凋亡的相互作用关系。方法：采用不同浓度IL-6诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖与活性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色观察细胞嗜酸性自噬泡情况,透射电镜观察细胞超微结构的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)以及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1, SQSTM1)/P62表达水平。进一步采用IL-6分别联合自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)诱导自噬或3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬,观察自噬对IL-6诱导血管内皮细胞凋亡的影响。结果：1. 与对照组相比,IL-6可以呈浓度依赖性降低血管内皮细胞的活性(P＜0.05),增加血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);2. IL-6浓度依赖性降低血管内皮细胞内LC3-II/LC3-I的表达(P＜0.05)而增加P62的表达(P＜0.05),在IL-6刺激下,MDC 染色观察可见血管内皮细胞内自噬泡逐渐减少(P＜0.05),荧光强度明显减弱,透射电镜下表现为自噬小体明显减少;3. 采用自噬抑制剂3-MA刺激血管内皮细胞,发现3-MA可以进一步抑制IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而增加凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达进一步下降(P＜0.05)和P62的表达进一步增加(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量明显减少(P＜0.05),并且3-MA可以进一步增加IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);4. 进一步采用自噬促进剂RP刺激血管内皮细胞,发现RP可以改善IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而降低凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达升高(P＜0.05)和P62的表达下降(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量的增多(P＜0.05),并且RP可以明显减少IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05)。结论：白介素-6可通过抑制自噬而增加血管内皮细胞凋亡。     

O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在顺铂激活的胃癌细胞自噬中的作用

目的 探讨DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)在顺铂(cisplatin)激活的胃癌SGC-7901细胞自噬中的作用.方法 Western blot法检测自噬底物蛋白p62水平、自噬标志分子Ⅱ型和Ⅰ型微管相关蛋白轻链3(mircotuble-associated protein light chain 3,LC3)的比值变化、MGMT蛋白水平;GFP-LC3表达质粒转染胃癌SGC-7901细胞后用激光共聚焦显微镜观察顺铂对细胞自噬小体形成的影响.qRT-PCR法检测MGMT基因mRNA表达水平.结果 顺铂剂量依赖性激活胃癌SGC-7901细胞自噬水平,显著增加SGC-7901细胞中自噬小体数量;MGMT mRNA及蛋白水平随顺铂浓度的增加而降低(P＜0.05);过表达MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞的基础自噬水平;过表达MGMT抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬.结论 DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬.     

褪黑素通过激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长和转移

目的 探讨褪黑素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和转移的作用及其机制。方法 将MDA-MB-231细胞设置对照组以及1、3、5 mmol/L褪黑素处理组,Western blot检测自噬对细胞生长、转移的影响时,添加3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合褪黑素组。使用不同浓度褪黑素处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48 h,并加入0.1%无水乙醇的细胞作为对照,CCK-8法检测细胞增殖活性确定最佳处理浓度和时间,筛选出3 mmol/L褪黑素用于后续实验。集落形成实验及划痕实验检测不同浓度褪黑素对乳腺癌细胞集落形成能力和迁移能力的影响;流式细胞术、免疫荧光检测3 mmol/L褪黑素对MDA-MB-231细胞凋亡率和自噬蛋白阳性着色情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl2、Bax,上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Snai1的水平。结果 CCK-8结果显示,与对照组相比,褪黑素呈浓度及时间依赖性抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05）;集落形成实验显示,3个浓度褪黑素处理组的集落数低于对照组;褪黑素作用24 h后明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合速度（P<0.01）,并诱导细胞凋亡率增加（P<0.01）;且与对照组相比,褪黑素组的促凋亡蛋白Bax表达增加（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调（P<0.05）,Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P<0.01）;转录因子Snail减少,上皮细胞标志蛋白E-cadherin增加;单独使用褪黑素能够诱导细胞内自噬标记蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1表达增加,P62表达减少（P<0.05）以及Beclin1蛋白阳性着色增强,P62蛋白阳性着色减弱;3-MA+褪黑素组中自噬相关蛋白Beclin1（P<0.001）、LC3-ΙΙ/LC3-（Ι P<0.05）以及凋亡蛋白Bax（P<0.01）、上皮细胞标志蛋白E-cadherin（P<0.001）明显低于褪黑素组,抗凋亡蛋白Bcl2（P<0.05）、转录因子Snail以及Bcl2/Bax的比值（P<0.01）高于褪黑素组。 结论 褪黑素可通过诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生自噬,抑制乳腺癌细胞增殖、转移并促进其凋亡,而减少自噬,可减弱褪黑素对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用。     

丝胶蛋白通过自噬通路调控人胃癌MKN45细胞的增殖

目的探索丝胶蛋白对胃癌MKN45细胞增殖活性的影响及作用机制。方法用LC3双荧光自噬病毒转染胃癌MKN45细 胞,用嘌呤霉素筛选LC3双荧光自噬病毒的MKN45稳转株。实验分为3组,空白对照组（Blank）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）、丝 胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA）。培育48 h后用cck-8试剂测定细胞增殖活性,根据所测数据得出丝胶蛋白半数致死浓 度IC50,按此浓度处理细胞并培育48h,用流式细胞仪分别检测凋亡、周期,电镜检测细胞自噬,Western blotting检测LC3、p62、 Beclin蛋白表达。将种植胃癌的裸鼠分为2组,即对照组（Saline）、丝胶蛋白阳性组（Sericin）,每组5只;分别注射生理盐水和丝 胶蛋白,测量肿瘤体积和质量。结果丝胶蛋白阳性组（Sericin）与空白对照组（Blank）相比,MKN45细胞增殖活性明显受到抑 制,且细胞凋亡增加（P<0.01）,细胞阻滞于G2/M期（P<0.01）。相对于空白组,丝胶蛋白处理后细胞在电镜观察到自噬小体明显 增多;Western blotting检测到LC3-2 表达上调,Beclin表达增加,p62表达逐渐下调;丝胶蛋白加自噬抑制剂组（Sericin+3-MA） 实验结果则介于两者之间。动物实验中,丝胶蛋白阳性组（Sericin）与对照组（Saline）相比,肿瘤体积和质量有显著下降。结论 丝胶蛋白可通过调控胃癌MKN45细胞自噬影响细胞增殖活性。     

自噬在脂多糖诱导成牙本质细胞凋亡中的作用

目的 探讨自噬在脂多糖（LPS）诱导成牙本质细胞（mDPC-23）凋亡中的作用。方法 将5 μg/mL脂多糖作用于成牙本质细胞0、6、12、24 h后,CCK8检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡。5 μg/mL脂多糖作用细胞24 h后,用Western blot检测自噬标志蛋白LC3、Beclin1和Atg5以及自噬相关通路AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表达水平。以脂多糖（5 μg/mL）和脂多糖（5 μg/mL）+3-甲基腺嘌呤（3-MA,5 mmol/L）为实验组,不加脂多糖或3-MA为空白对照组,作用细胞24 h后,Western blot检测凋亡蛋白Caspase 3和Bax的表达水平。结果 脂多糖作用mDPC-23细胞6、12 h,细胞增殖能力和凋亡无明显变化;作用24 h后,其增殖能力较对照组显著降低（P<0.05）,凋亡水平较作用0 h明显增加（P<0.05）。且脂多糖作用mDPC-23细胞24 h后,自噬标志蛋白LC3、Beclin1和Atg5表达较对照组均明显增加（P<0.05）,通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR较对照组表达下降（P<0.05）。脂多糖组凋亡蛋白Caspase 3和Bax显著高于对照组（P<0.05）;脂多糖+3-MA组中凋亡蛋白明显低于脂多糖组（P<0.05）。结论 脂多糖可通过诱导mDPC-23自噬发生以促进细胞凋亡;而抑制自噬,可减弱脂多糖的促凋亡作用,提示在炎性牙髓组织损伤中,自噬发挥重要作用。     

过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

IL-17A/IL-17RA通过上调自噬降低卵巢癌SKOV3细胞对顺铂敏感性

目的 探讨白细胞介素（IL）17A通过调控细胞自噬对卵巢癌细胞顺铂（DDP）化疗敏感性的影响。方法 体外培养卵巢癌SKOV3细胞并分别用不同浓度DDP（1、2、4、6、8、10、15、20 μg/mL）处理,MTT法测定细胞增殖活性以及IL-17A（100 ng/mL,处理24 h）对DDP 诱导SKOV3细胞凋亡的影响;流式细胞术检测人卵巢癌细胞SKOV3中IL-17A受体（IL-17RA）的表达水平;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测细胞早期凋亡情况;IL-17RA 中和抗体（IL-17RA mAb）进行IL-17RA阻断实验;合成针对IL-17RA基因的siRNA片段（siRNA-IL-17RA）,转染SKOV3细胞,沉默IL-17RA表达;3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制细胞自噬水平;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、Cleaved Caspase3）、自噬相关蛋白（P62、Beclin-1）表达。结果 DDP可以增加卵巢癌SKOV3细胞IL-17RA表达水平;IL-17A降低SKOV3细胞对DDP的敏感性（P<0.05）;DDP诱导SKOV3细胞内自噬相关蛋白Beclin-表达增强,自噬降解底物P62蛋白减少;IL-17A/IL-17RA增强了DDP自噬诱导作用（P<0.05）;3-MA 阻断自噬后,SKOV3细胞凋亡率较干扰前明显升高,细胞抗凋亡蛋白Bcl2表达水平降低、凋亡蛋白Bax表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 IL-17A/IL-17RA可能通过上调DDP诱导的自噬水平降低人卵巢癌SKOV3细胞化疗敏感性。     

3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制

目的：通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）,观察顺铂（DDP）对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制。方法： 将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+DDP处理组和DDP+3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：Tca83细胞株对顺铂IC₅₀值为5 mg/L;MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组 (P<0.05),高于3-MA+ DDP组 (P<0.05);细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组（P<0.05）;流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组 (P<0.05),高于DDP+3-MA组 (P<0.05)。结论：不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂。     

藁本内酯对骨肉瘤细胞凋亡的影响及其作用机制

目的 探讨藁本内酯对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡的影响及其作用机制。方法 DMEM培养基培养骨肉瘤MG-63细胞,采用细胞毒性实验观察藁本内酯对MG-63细胞增殖的影响;细胞划痕实验检测藁本内酯对骨肉瘤细胞迁移的影响;流式细胞仪检测不同浓度藁本内酯对骨肉瘤细胞周期的影响。明确藁本内酯作用MG-63细胞的浓度,将细胞分为对照组、顺铂（DDP）组,藁本内酯联合顺铂（DDP+LIG）组,顺铂联合自噬抑制剂（DDP+3MA）组。Western blotting检测自噬和凋亡相关蛋白LC3B、Beclin1、Bcl-2、Bax,细胞色素C以及通路蛋白ULK1、ATG3的表达情况。免疫荧光检测各组细胞LC3B蛋白的表达情况。结果 与对照组比较,20、40、80、160、320、640μmol/L藁本内酯作用下骨肉瘤细胞增殖均被抑制（均P <0.05）;与对照组比较,160μmol/L藁本内酯作用下骨肉瘤细胞迁移能力显著降低（P <0.01）。与对照组比较,40、80、160、320、640μmol/L藁本内酯作用下骨肉瘤细胞G2/M期细胞均显著阻滞（均P <0.05）。与DDP组比...     

沉默Beclin1基因对β-榄香烯抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖与诱导自噬的影响

目的探讨Beclin1基因对β-榄香烯抗人胃癌SGC-7901细胞增殖及自噬诱导的影响。方法用前期实验构建成功的GV112-Beclin1-shRNA1(short hairpin RNA,短发夹RNA)慢病毒载体感染人胃癌SGC-7901细胞。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测β-榄香烯对SGC-7901细胞增殖的抑制作用,以及沉默Beclin1基因后对β-榄香烯抗增殖能力的影响。免疫蛋白印迹(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3-II、P62的表达,评价β-榄香烯作用SGC-7901后的自噬水平和Beclin1基因沉默对β-榄香烯诱导自噬的影响。结果 MTT法显示,β-榄香烯能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,抑制作用随浓度的增加而递增(浓度为20、50、100μg/mL比0μg/mL时,抑制率为21.5%、31.7%、37.4%比0,P<0.05);沉默Beclin1基因后β-榄香烯抑制胃癌SGC-7901细胞抑制率增加(42.3%比36.1%,P<0.05)。Western blot法显示,β-榄香烯能诱导SGC-7901细胞发生保护性自噬,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达上调,P62蛋白表达下降,沉默Beclin1基因可抑制β-榄香烯对SGC-7901细胞保护性自噬的增强,LC3-Ⅱ蛋白表达水平下降,P62蛋白表达增加。结论β-榄香烯可诱导胃癌SGC-7901细胞发生保护性自噬,下调Beclin1基因有助于降低保护性自噬的发生,从而增强β-榄香烯的抗癌效果。     

20(S)-原人参二醇对体外培养siha细胞自噬的影响

目的：观察20(S)-原人参二醇（PPD）对人子宫颈癌siha细胞生长的抑制作用及其对自噬基因Beclin 1及MAP1-LC3转录和表达的影响，探讨PPD抑制siha细胞增殖的机制。方法：体外培养人宫颈癌siha细胞分为阴性对照组（乙醇）、阳性对照组（40 μmol·L^-1顺铂）及PPD 10、20和40 μg·L^-1组，分别用乙醇、顺铂和PPD处理细胞24、48、72和96h后，MTT法检测siha细胞增殖抑制率，RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学染色法观察各组siha细胞自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3的转录及蛋白表达情况。结果：与对照组比较，PPD 10、20和40 μg·L^-1组细胞增殖抑制率明显增加（P<0.05），且随时间延长和剂量的增加而逐渐提高，自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3的转录水平及蛋白表达水平明显上调（P<0.01）。结论：PPD可抑制体外培养siha细胞增殖，诱导siha细胞发生自噬。其机制可能与上调自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3表达有关。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌组织中的表达及意义

目的探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌（PCa）中的表达情况及其临床意义。方法收集60例PCa标本（观察组）和15例良性前列腺增生（BPH）标本15例（对照组）。应用免疫组化法检测PCa组织和BPH组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5的表达情况,比较两组间的差异;分析PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白的表达情况与PCa的Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移等临床参数之间的关系。结果PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ阳性表达率（38.3%、33.3%）明显低于BPH组织（60.0%、53.3%）,而PCa组织中Atg5阳性表达率（83.3%）显著高于BPH组织（6.7%）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Beclin1与LC3-Ⅱ的表达呈正相关,两者与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移有关（均P＜0.05）,而与年龄无关（P＞0.05）。Atg5的表达与年龄、Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均无关（均P＞0.05）。结论自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa中的异常表达,提示自噬活动增强和自噬体形成增多在PCa发展过程中起着重要作用。     

参元丹含药血清对心肌缺血保护作用及其微管相关蛋白及自噬相关基因表达的影响

目的：通过参元丹胶囊含药血清对心肌细胞活性、培养液上清乳酸脱氢酶（LDH）活性、LC3微管相关蛋白LC3及自噬相关基因Beclin1-mRNA表达影响的研究,探讨参元丹胶囊对心肌缺血保护作用及作用机制。方法：分离1～3天龄Wistar大鼠心肌细胞进行细胞培养,采用无血清无糖培养建立心肌缺血细胞模型,于不同时间点加入参元丹胶囊含药血清,采用MTT法、比色法、蛋白免疫印迹技术（Western Blot）及逆转录PCR（RT-PCR）测定细胞活性、上清培养LDH含量、微管相关蛋白LC3蛋白（LC3I及LC3II）表达及哺乳动物自噬相关基因Beclin1-mRNA表达。结果：10%参元丹含药血清与相应时间点10%空白血清比较,能明显增加心肌缺血模型中3、6、18及24h心肌细胞活性（P〈0.01）、降低培养液上清LDH活性（P〈0.05）;通过计算LC3II/LC3I比值发现参元丹含药血清能明显抑制缺血诱导24h的细胞自噬活性（P〈0.05）,而对心肌缺血模型各个时间点Beclin1-mRNA的表达没有影响。结论：参元丹含药血清对心肌细胞缺血损伤有保护作用,并可以在心肌细胞缺血较长时间后抑制自噬的活性,但其对自噬活性的影响可能与Beclin1表达无关。