PI3K抑制剂对三阴性人乳腺癌细胞株MBA-MB-231/ADR的多药耐药逆转作用

目的探讨PI3K抑制剂对三阴性人乳腺癌细胞多药耐药的逆转作用及其与PI3K/Akt信号转导关系。方法采用MTT法测定三阴性乳腺癌细胞系MBA-MB-231及其多药耐药细胞株MBA-MB-231/ADR对经典化疗药物阿霉素的半数抑制浓度(IC50),以及MBA-MB-231/ADR细胞株在PI3K抑制剂LY294002给药前后对阿霉素的敏感性差异。Western Blot检测MDA-MB-231/ADR细胞株LY294002给药前后,P-Akt、Akt、IκBα、NF-κB、P-gp和cleaved-caspase-3表达水平差异。结果 1MBA-MB-231和耐药细胞株MBA-MB-231/ADR对阿霉素的IC50分别为(0.36±0.03)μmol/L和(16.77±1.57)μmol/L,耐药倍数为46.58倍。2LY294002给药后,耐药细胞株MBAMB-231/ADR对阿霉素的IC50降至(2.59±0.07)μmol/L,耐药倍数降至6.475,对药物敏感性显著增加。3耐药细胞株MBA-MB-231/ADR中PI3K/Akt和NF-κB通路被激活,细胞耐药相关蛋白P-gp处于高表达水平;LY294002处理之后,MBA-MB-231/ADR细胞中PI3K/Akt和NF-κB通路被抑制,P-gp表达水平下调,细胞凋亡相关的cleaved-caspase-3表达上调。结论 PI3K抑制剂LY294002能有效逆转耐药细胞株MBA-MB-231/ADR的耐药性,从而增强耐药细胞MBA-MB-231/ADR对化疗药物阿霉素的敏感性。该研究结果提示LY294002通过阻断PI3K/Akt通路抑制下游NF-κB通路的活化和P-gp表达上调,从而参与MBA-MB-231/ADR耐药性的逆转。     

Bmi-1介导的K562/ADR细胞多药耐药机制

目的:观察Bmi-1基因沉默对白血病耐药细胞株K562/ADR耐药性的影响并初步探讨其机制。方法:将2种序列的Bmi-1小干扰RNA SiRNA转染到耐药细胞K562/ADR,检测Bmi-1基因m RNA和蛋白的表达以确定转染效果。检测Bmi-1基因沉默后耐药蛋白P-gp及其编码基因MDR1的表达情况,并采用流式细胞术检测细胞内阿霉素蓄积情况。检测Bmi-1基因沉默后NF-κB蛋白的表达变化;应用NF-κB抑制剂PDTC处理K562/ADR细胞抑制NF-κB活性后,检测P-gp蛋白的表达及其功能的变化。检测Bmi-1基因沉默后PTEN、AKT和p-AKT蛋白表达的变化。应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理K562/ADR细胞抑制p-AKT表达后,检测NF-κB和P-gp蛋白的表达。应用PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默后的细胞,检测AKT、p-AKT、NF-κB和P-gp蛋白的表达。以上mRNA表达用RT-PCR法检测,蛋白表达用Western blot法检测。结果:在mRNA水平和蛋白水平2种序列的小干扰RNA均使K562/ADR细胞Bmi-1基因表达降低。MDR1/P-gp在Bmi-1 siRNA干扰细胞中的表达明显低于在K562/ADR细胞的表达(P0.05);干扰后细胞内阿霉素蓄积增多。Bmi-1基因沉默后,细胞NF-κB活性降低;NF-κB抑制剂抑制NF-κB活性后,K562/ADR细胞P-gp蛋白表达及药物泵出功能被抑制。Bmi-1基因沉默后PTEN蛋白表达增高,而p-AKT蛋白表达明显降低(P0.05)。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002抑制p-AKT表达后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达明显下降(P0.05)。PTEN抑制剂BPV(phen)处理Bmi-1基因沉默细胞后,NF-κB活性和P-gp蛋白表达得到重塑。结论:Bmi-1在MDR1/P-gp介导的K562/ADR细胞多药耐药中起关键作用,这种作用可能是通过激活PTEN/AKT途径调控NF-κB完成。     

Ibrutinib逆转SDF-1α/CXCR4介导的急性淋巴细胞白血病耐药机制

目的:探讨在急性淋巴细胞白血病细胞株SUP-B15中Ibrutinib对SDF-1α/CXCR4轴介导的耐药影响。方法:流式细胞术检测细胞凋亡及细胞表面CXCR4表达情况,Western blot检测CXCR4、ERK、Bcl-xL表达水平,qPCR检测CXCR4的mRNA表达水平。结果:Ibrutinib增强化疗药物阿霉素诱导SUP-B15的凋亡(17.100%±4.3%vs28.133%±3.16%);Ibrutinib抑制SDF-1α诱导的CXCR4磷酸化,呈浓度和时间依赖性(r_(24h)=-0.99659,r_(48h)=-0.99764,r=-0.99980);Ibrutinib抑制CXCR4下游信号分子ERK、BCL-xL的表达与活性。结论:Ibrutinib增强SUP-B5细胞株对化疗药物阿霉素的敏感性,逆转SDF-1α/CXCR4轴介导的耐药,其可能的作用机制是通过抑制CXCR4/ERK/BCL-xL信号通路而实现的。     

肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM的建立及耐药机制研究

目的建立人肝癌多药耐药细胞系并研究其耐药特性及机制。方法应用人肝癌细胞株HepG2,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系HepG2/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。结果HepG2/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了89.38倍。流式细胞仪分析发现(45.5±5.1)%的HepG2/ADM细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞HepG2表达仅为(11.3±1.2)%,二者差异有显著性(P<0.01);HepG2/ADM和HepG2细胞的MRP及GSH/GST表达无明显变化(P>0.05)。RT-PCR检测发现HepG2/ADM中MDR mRNA高表达。结论HepG2/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR mRNA表达升高。     

急性淋巴细胞白血病阿糖胞苷耐药细胞株的构建及机制研究

目的:构建耐阿糖胞苷(Ara-C)的急性淋巴细胞白血病(ALL)耐药细胞株,并探讨可能耐药机制。方法:低浓度Ara-C持续诱导培养Jurkat和Nalm-6细胞,构建Jurkat/Ara-C和Nalm-6/Ara-C耐药细胞株。CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期分布,实时荧光定量PCR检测多药耐药基因和Ara-C代谢酶m RNA表达水平,免疫印迹法检测细胞周期蛋白表达水平。结果:成功构建了Jurkat/Ara-C和Nalm-6/Ara-C耐药细胞株,耐药指数分别为1 973.908±161.163和7 231.643±1 190.624,耐药细胞株对阿霉素等常用化疗药物无交叉耐药。流式细胞术检测结果显示,Jurkat/Ara-C细胞G0/G1期比例增加(P0.05),G2/M期减少(P0.05),而Nalm-6/Ara-C细胞周期分布较Nalm-6细胞无明显改变。实时荧光定量PCR检测发现脱氧胞苷激酶和胞苷脱氨酶在耐药细胞中低表达(P0.05),MRP在Nalm-6/Ara-C细胞中高表达(P0.05),MDR1、LRP和BCRP未见明显增加。蛋白免疫印迹检测发现Cyclin B1在耐药细胞中明显低表达(P0.05),Cyclin D1未见明显改变。结论:低浓度持续诱导法成功构建了ALL耐Ara-C细胞株,其耐药机制可能与脱氧胞苷激酶和Cyclin B1的缺乏有关。     

人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究

目的建立人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐药模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐药模型(MDA-MB-231/Epi),探讨其生物学特性。方法采用Doc和EPi低浓度逐步加量诱导法历时12个月分别建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药细胞株。通过细胞形态学观察、MTT法和流式细胞术分析、比较其生物学特性,实时荧光定量PCR检测多药耐药基因(MDR1)mRNA表达,Western Blot法检测P糖蛋白(P-gp)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)的表达状况。结果所构建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株可分别在12nmol/L Doc和800nmol/L Epi中稳定生长,在相同的药物浓度下,耐药细胞株的生长增殖率明显高于亲代细胞,其耐药指数分别为亲代敏感细胞的8.32倍和64.93倍,且相互呈交叉耐药状态。与亲代细胞相比,两株耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、处于S期的细胞减少,随撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快。两株耐药株的MDR1基因表达水平增高,分别为亲代细胞的4.05倍和5.96倍,P-gp表达为阳性。与MCF-7细胞株相比,MDA-MB-231细胞株ER、PR、HER2表达阴性,是典型的三阴性乳腺癌细胞株。结论成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐药细胞株,其生长及耐药性稳定。     

冬凌草甲素抗Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病效应的实验研究

目的 探讨冬凌草甲素对Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗白血病效应及其机制.方法 以Ph+ALL细胞株SUP-B15为研究对象,应用改良MTT法测定冬凌草甲素对SUP-B15细胞增殖的影响,计算72 h的半数抑制浓度(IC50);光学显微镜下观察冬凌草甲素处理后SUP-B15细胞的形态学变化;用流式细胞术检测药物作用前后SUP-B15细胞的凋亡率;以K562细胞为对照,应用Western blot法比较药物作用前后SUP-B15细胞Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导通路活化水平,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化.结果 ①冬凌草甲素呈浓度及时间依赖地抑制SUP-B15细胞增殖,作用72 h的IC50值为(7.08±1.21)μmol/L;②冬凌草甲素处理24 h后光学显微镜下SUP-B15细胞边界不清晰,部分细胞崩解;③0、5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后,SUP-B15细胞凋亡百分率分别为(6.67±0.83)%、(18.30±1.79)%、(37.63±7.12)%;④冬凌草甲素明显抑制SUP-B15细胞ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5多条信号转导通路的活化;下调SUP-B15细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达.结论 冬凌草甲素通过抑制ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导,以及上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2而发挥抗Ph+ALL作用.     

细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素逆转多药耐药的研究

目的:探讨细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素逆转多药耐药的可能性及其机制。方法:以人外周血分离单个核细胞后进行体外诱导、扩增作为效应细胞,联合不同浓度的阿霉素与其耐药靶细胞K562/ADR进行共培养,经四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法计算半数抑制浓度(IC50)、耐药倍数和逆转倍数;流式细胞仪检测细胞内阿霉素相对含量和P糖蛋白表达水平;RT-PCR检测mdr-1基因mRNA表达。结果:未经细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素处理时,阿霉素对K562和K562/ADR的IC50分别为(0.68±0.04)μmol/L和(66.23±4.38)μmol/L;K562/ADR对阿霉素的耐药倍数为97.43倍;经细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素处理48 h(效靶比1∶5、阿霉素1.1μmol/L)后,IC50为(32.15±0.79)μmol/L,联合逆转倍数为2.06倍,细胞内的阿霉素相对含量增加1.83倍;P糖蛋白表达下调36.7%,mdr-1基因mRNA相对表达值也呈下调趋势。结论:细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素可提高耐药细胞K562/ADR胞内的阿霉素浓度,下调mdr-1基因及P糖蛋白的表达,提高阿霉素对耐药细胞K562/ADR的敏感性,使细胞因子诱导杀伤联合阿霉素对多药耐药的逆转效果得以显现。     

华蟾素对Raji/ADR细胞多药耐药的逆转作用及机制

本研究旨在探讨华蟾素对Raji/ADR细胞多药耐药的逆转作用及其机制.采用MTT法检测华蟾素对Raji及Raji/ADR细胞的生长抑制率、半数抑制浓度（IC50）、逆转阿霉素耐药倍数,并绘制生长抑制率曲线;应用RTPCR法测定MDR-1和MRP-1基因的转录;Western blot法和流式细胞术法测定P-gp、MRP-1蛋白的表达.结果表明：华蟾素对Raji及Raji/ADR细胞72 h增殖抑制率为75.6％和69.3％,IC50分别为3.9 mmol/L和4.6 mmol/L,逆转阿霉素耐药倍数为255.7倍.华蟾素作用于Raji/ADR前后,MDR-1和MRP-1基因转录水平明显下降（P＜0.05）,P-gp和MRP-1蛋白表达明显降低.结论华蟾素可逆转Raji/ADR细胞对阿霉素的耐药,其机制为通过转录途径下调P-gp和MRP-1蛋白的表达.华蟾素是一种有效的肿瘤多药耐药逆转剂.     

细胞因子诱导杀伤细胞联合阿霉素逆转人红白血病耐药细胞株K562/ADR的研究

目的 探讨细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞与阿霉素对肿瘤多药耐药逆转作用的影响.方法 体外诱导、扩增人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞,联合不同浓度的阿霉素与其耐药靶细胞K562/ADR进行共培养,经四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法计算半数抑制浓度(IC50)、耐药倍数和逆转倍数;流式细胞仪检测细胞内阿霉素相对含量和P糖蛋白(Pgp)表达水平;RT-PCR检测mdr-1基因mRNA表达.结果 阿霉素对K562和K562/ADR的IC50分别为(0.68±0.04)μmol/L和(66.23±4.38)μmol/L;K562/ADR对阿霉素的耐药倍数为97.43倍;经CIK细胞联合阿霉素处理48 h(效靶比1:5、ADR 1.1 μmol/L)后,IC50为(32.15±0.79)μmol/L,联合逆转倍数为2.06倍.细胞内的阿霉素相对含量增加的同时Pgp表达降低.mdr-1基因mRNA相对表达值也呈下调趋势.结论 CIK细胞联合阿霉素可增加化疗药物阿霉素对耐药靶细胞K562/ADR的敏感性,提高耐药靶细胞内的阿霉素浓度,有效下调mdr-1基因及Pgp的表达,使CIK联合阿霉素对多药耐药的逆转效果得以显现.     

人红白血病细胞来源的DC对细胞因子诱导的杀伤细胞逆转多药耐药的影响

目的:探讨人红白血病细胞(K562/ADR)来源的DC与CIK细胞体外共培养后对多药耐药逆转影响。方法:K562敏感株和K562/ADR耐药细胞株,在含细胞因子GM-CSF(1000u/mL)、IL-4(500u/mL)和TNF-α(100ng/mL)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC。同时将PBMC在细胞因子诱导下培养成细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),与成熟DC进行共培养。采用MTT法测定免疫效应细胞对靶细胞杀伤率、耐药性逆转。流式细胞术检测靶细胞的Pgp表达及细胞内的ADR浓度,RT-PCR检测MDR1基因表达状况。结果:K562/ADR来源的DC与CIK细胞共培养后,细胞增殖速度明显加快,17d以后两者的增殖倍数呈现明显差异。效应细胞对靶细胞的生长抑制率高达78.9%,与单纯CIK细胞相比较显示出高特异免疫杀伤作用。结论:CIK K562/ADR-DC对P-gp高表达K562/ADR耐药细胞株具有特异性的细胞毒作用,有效提高了细胞内的ADR含量,下调了P-gp、mdr-1表达,从而使免疫效应细胞体外逆转多药耐药的效果得以显现。     

PP242对Ph+急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制作用及对AKT1-Ser473磷酸化的影响

目的观察ATP竞争性哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)抑制剂PP242对体外培养的Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞增殖和AKT1473位丝氨酸磷酸化的影响。方法对Ph+ALL细胞株SUP-B15进行培养及传代,Cell Counting Kit-8比色法检测PP242(100 nM,250 nM,500 nM,750 nM,1 000 nM)处理细胞株SUP-B15后12 h、24 h、48 h细胞生长情况;应用免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测使用PP242(100 nM,250nM,500 nM)培养细胞48 h后AKT1及磷酸化水平情况。结果 100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 000 nM PP242对Ph+ALL细胞株SUP-B15作用12 h、24 h及48 h后,其抑制率:12 h组:10.17%,13.25%,20.13%,22.54%,27.61%;24h组:11.33%,20.54%,36.18%,41.66%,47.27%;48 h组:23.13%,39.24%,55.72%,61.88%,66.93%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);100 nM、250 nM、500 nM PP242处理SUP-B15细胞48 h后,免疫印迹法检测结果显示AKT1蛋白的表达水平无明显变化,而473位丝氨酸(Ser473)磷酸化水平逐渐降低;实时定量RT-PCR检测结果显示,AKT1的mRNA表达无明显变化,绝对定量mRNA结果分别为:0.673±0.124,0.751±0.133,0.689±0.154,与正常对照组(0.679±0.167)相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ATP竞争性mTORC2抑制剂PP242对体外培养的Ph+ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖存在抑制作用,其作用强度呈浓度和时间依赖性;SUP-B15细胞中存在AKT1的表达;PP242在抑制Ph+ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖过程中可下调AKT1Ser473磷酸化水平。     

孤啡肽联合阿霉素逆转K562/ADM细胞多药耐药及其分子机制研究

本实验室已研究证实,在细胞水平孤啡肽(OFQ)单独用药可逆转K562/ADM细胞多药耐药。本研究目的是探索OFQ联合阿霉素(ADM)逆转K562/ADM细胞多药耐药的分子机制及其与MDR1 mRNA/P-gp表达的相关性。MTT法检测OFQ和ADM单药及两者联合后对K562/ADM细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测MDR1 mRNA表达水平,Western blot检测P-gp的相对表达量。结果显示,OFQ(0.1μmol/L)联合ADM(15 mg/L)后细胞增殖抑制率增加,与ADM组比较,48 h数据具有统计学意义(P<0.05),细胞凋亡率显著提高(P<0.01);OFQ联合ADM作用于细胞后MDR1 mRNA/P-gp表达水平明显低于ADM单独用药组(P<0.01),且MDR1 mRNA(r=0.91)及P-gp(r=0.98)表达水平在48 h内呈时间依赖性。结论:OFQ联合ADM可时间依赖性的逆转K562/ADM细胞多药耐药性,48 h为最佳逆转时间,逆转机制与下调MDR1 mRNA和P-gp的表达量相关。     

汉防己甲素、托瑞米芬及其联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

本研究探讨汉防己甲素（Tet）、雌激素受体抑制剂托瑞米芬（Tor）及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。采用噻唑蓝法（MTT）测定阿霉素（ADR）的半数抑制量,RT-PCR法检测MDR1基因mRNA表达水平,FCM检测P-gp的表达和细胞内ADR浓度。结果表明：ADR对K562/A02和K562细胞的IC50分别为57.43和1.16mg/L,Tet（1μmol/L）和Tor（2.5μmol/L）单用及两药联用处理K562/A02细胞时,ADR的IC50值分别为14.12,20.74和9.14mg/L。Tet及Tor单独作用后耐药株MDR1 mRNA下调微弱,联合用药下调效果明显。Tet及Tor均可降低P-gp蛋白的表达,且具有协同作用。Tet及Tor作用后细胞内ADR浓度增加,两药联合作用时效果增强。结论：Tet及Tor均可逆转K562/A02细胞多药耐药,联合作用时效果增强。     

低氧诱导因子-1α抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药机制研究

目的 探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh(YC-1)对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的耐药逆转作用,并探讨逆转机制.方法 采用MTT法检测不同浓度YC-1和阿霉素(ADM)单独或联合使用48 h对K562/A02细胞和K562细胞增值抑制效应及耐药逆转效应;用流式细胞术检测0、5、10和20 μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素作用K562/A02细胞48 h后细胞凋亡率及联合应用后细胞内阿霉素浓度;半定量RT-PCR检测各组细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、mdr1基因mRNA表达变化;Western blot方法检测各组细胞HIF-1α、P-糖蛋白(P-gp)表达变化.结果 K562与K562/A02细胞对阿霉素的IC50值分别为(1.56±0.07)mg/L和(42.98±3.15)mg/L,耐药倍数为27.55倍.予5、10和20μmol/L YC-1作用后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为24.63、16.38和10.71倍;0、5、10和20μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后,凋亡率分别为(1.9±0.9)%、(4.9±0.9)%、(5.8±1.1)%和(9.3±1.4)%与(2.3±0.7)%、(8.2±1.2)%、(19.0±1.7)%和(34.5 ±2.4)%.0、5、10和20 μmol/L YC1联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后细胞内阿霉素荧光强度分别为232±33、1300±219、1961±240和3342±269;随着YC-1浓度增加,HIF-1α mRNA表达没有明显差异,mdr1 mRNA逐渐下调,HIF-1±和P-gp表达均下调.结论 YC-1可以通过抑制HIF-1α蛋白表达,下调mdr1 mRNA水平和P-gp水平,增加细胞内阿霉素药物浓度,部分逆转K562/A02细胞耐药.     

CIK逆转K562/ADR细胞多药耐药作用及其机制探讨

目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外逆转阿霉素(ADR)耐药细胞株K562/ADR细胞多药耐药(MDR)的作用,并探讨其机制.方法 健康人外周血单个核细胞经细胞因子体外诱导获得CIK,检测其表型和培养上清液细胞因子含量.实验组为CIK作用于K562/ADR细胞48 h后加入ADR;对照1组为CIK作用于K562/ADR细胞48 h,对照2组为ADR作用K562/ADR细胞48 h.采用MTT法检测各组细胞杀伤活性,用流式细胞术检测细胞膜P-糖蛋白(P-gp)含量、细胞内ADR浓度等.结果 实验组对K562/ADR细胞杀伤活性高于对照1组(P＜0.05);且随效靶比增大,杀伤活性增大(P＜0.05);随所加入的ADR浓度增大,杀伤活性无明显变化(P＞0.05).实验组和对照1组的P-gp含量均下降(P＞0.05).实验组细胞内ADR浓度高于仅经ADR作用的对照组2组(P＜0.05),但细胞内ADR浓度与加入的ADR浓度无明显关系(P＞0.05).结论 通过CIK与ADR对K562/ADR细胞的先后作用,降低了其细胞内P-gp的表达,提高了K562/ADR细胞内ADR浓度,增强了ADR对耐药细胞的杀伤活性.为应用生物活性细胞逆转MDR提供理论依据.

Abstract：

Objective To investigate the effects and mechanism of cytokine-induced killer(CIK) cells in reversing multidrug resistance(MDR) and increasing intracellular concentration of adriamycin(ADR)in the K562/ADR cells. Methods Peripheral mononuclear cells (MNCs) were isolated from healthy donors and cultured with combined cytokines to generate CIK. The changes of cell phenotype and cytokines secretion of CIK were determined. K562/ADR cells were divided into three groups: ADR in combination CIK (group Ⅰ ), CIK alone (group Ⅱ ) and ADR alone (groupⅢ) . The viability and proliferation of K562/ADR cells were assayed by MTT assay, the intracellular concentration of ADR and the expression of P-glycoproteins (P-gp) in K562/ADR cells by FCM. Results The cytotoxicity of ADR in group Ⅰ was higher than that in group Ⅱ ( P ＜0.05 ). The cytotoxicity was increased with the E/T ratio increasing( P ＜0.05 ) but had no relation with the concentration of ADR in group Ⅰ (P＞0.05). The expression of P-gp was declined in group Ⅰ and group Ⅱ (P ＞0.05 ). The intracellular concentration of ADR in group Ⅰ was higher than that in group Ⅱ ( P ＜ 0.05 ), and had no relation with the ADR concentration ( P ＞ 0.05 ). Conclusion Pre-treatment with CIK can increase the cytotoxicity and the intracellular concentration of ADR and decrease the expression of P-gp in K562/ADR cells in the ADR and CIK combination group. Acute leukemia patients would be most likely to benefit from the combination of chemotherapy and CIK therapy.     

高压氧对槲皮素逆转肺腺癌A549/DDP细胞耐药的影响及其机制

目的探讨高压氧环境下槲皮素在体外对肺腺癌A549/DDP细胞株耐药的逆转及其对P-gp和survivin蛋白表达的影响。方法 MTT法测定槲皮素在高压氧环境下对A549/DDP细胞耐药的逆转作用;流式细胞法(FCM)检测高压氧环境下A549/DDP细胞P-gp和survivin蛋白的表达。结果槲皮素在高压氧环境下使DDP对A549/DDP细胞的半抑制浓度(IC50)从(31.34±2.99)μg/ml下降至(7.56±0.87)μg/ml,其逆转倍数为4.15;高压氧处理A549/DDP细胞对P-gp的表达无显著影响(P>0.05),处理组AFI值为4.22±0.11,对照组AFI值为4.42±0.03;但能够显著降低survivin蛋白的表达(P<0.05),处理组AFI值为2.52±0.11,对照组AFI值为3.96±0.13。结论高压氧能增强槲皮素对肺腺癌A549/DDP细胞MDR的逆转作用;其增强作用可能通过降低survivin蛋白的表达实现。     

siRNA真核表达载体对白血病K562/ADR细胞凋亡的实验研究

目的特异性siRNA真核表达载体pSilenceneoMDR1和pSilenceneoGSTπ对白血病多药耐药细胞K562/ADR凋亡的影响。方法特异性siRNA真核表达载体pSilenceneoMDR1、pSilenceneoGSTπ共转染K562/ADR细胞,同时以空载体pSilencer2.1U6转染K562/ADR细胞(mock)作为对照。流式细胞仪检测细胞凋亡;MTT法检测阿霉素的半数抑制浓度(IC50)。结果流式细胞仪显示空载体pSilencer2.1U6转染细胞凋亡率为(11.65±4.06)%,pSilenceneoMDR1和pSilenceneoGSTπ共转染组细胞凋亡率(44.98±11.27)%,重组质粒转染组与空质粒转染组比较,差异有统计学意义,P<0.01。K562/ADR细胞对阿霉素的耐药指数为24,空载体转染后耐药指数为23,pSilenceMDR1、pSilenceGST共转染后耐药指数降低为7,半数抑制浓度(IC50)值分别从转染前(1.16±0.38)mol/ml下降为(0.33±0.04)mol/ml,重组质粒转染组与空质粒转染组比较,差异有统计学意义,P<0.01。结论siRNA真核表达载体pSilenceMDR1和pSilenceneoGSTπ可以诱导K562/ADR细胞发生凋亡,并且可有效逆转K562/Adr细胞株的多药耐药。     

藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用

本研究旨在探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对K562/A02细胞株的耐药逆转作用及其逆转机制。采用MTT法检测GA对K562和K562/A02细胞的增殖抑制作用及对K562/A02细胞阿霉素(ADM)耐药逆转效应;用流式细胞术检测GA联合ADM对K562及K562/A02细胞凋亡率的影响;DAPI荧光染色观察ADM联合GA作用后细胞的形态学改变;Western blot法检测K562及K562/A02细胞P-糖蛋白(P-gp)、存活蛋白(Survivin)基因的表达。结果表明:ADM作用48 h抑制K562和K562/A02细胞增殖的IC50值分别为(1.42±0.07)μg/ml和(28.42±1.40)μg/ml。GA≤0.0625μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显增殖抑制作用;0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞能增加其对ADM的敏感性,耐药逆转倍数为1.53。0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞48 h能提高细胞的凋亡率(P<0.05),下调Survivin及P-gp蛋白的表达(P<0.05)。结论:GA可以逆转K562/A02细胞的耐药性,增强耐药细胞对ADM的敏感性,其机制可能与提高K562/A02细胞凋亡、下调Survivin和P-gp蛋白的表达有关。     

低频低剂量超声逆转卵巢癌细胞多药耐药及机制研究

目的 研究低频低剂量超声逆转卵巢癌耐药细胞株(SKVO3/MDR1)多药耐药的有效性及其机制.方法 MTT法检测获得0.3 MHz,1.0 W/cm2超声辐照下逆转SKVO3/MDR1多药耐药的最适辐照时间,免疫荧光法检测最适超声辐照前后多药耐药糖蛋白P-gp的表达变化.结果 40 s为逆转肿瘤细胞多药耐药的最适超声辐照时间.最适辐照有效逆转了SKVO3／MDR1多药耐药性,显著降低了P-gp的表达(P＜0.01).结论 低频低剂量超声能有效逆转SKVO3/MDR1细胞株的多药耐药性,其机制与降低细胞膜P-gp的表达密切相关.