慢病毒介导稳定过表达β-catenin可促进间充质干细胞的增殖和迁移

背景：β-catenin 是 wnt/β-catenin 信号通路中最关键的信号分子,参与调控细胞增殖、分化以及组织自我修复的平衡。
　　目的：建立慢病毒介导的过表达β-catenin基因的大鼠间充质干细胞株,观察β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。
　　方法：构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP,采用人胚肾上皮细胞293T进行包装,收集、浓缩病毒,感染间充质干细胞株,经过嘌呤霉素加压筛选,建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。通过实时荧光定量 PCR、细胞生长曲线、MTT 实验、Transwel 体外细胞迁移实验研究稳定过表达β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。
　　结果与结论：成功包装靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP,建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。与空载对照pLV-RFP组和正常间充质干细胞组相比,实时荧光定量PCR证实,慢病毒pLV-catenin-RFP组mRNA表达明显增高(P<0.05);MTT和生长曲线显示pLV-catenin-RFP组使细胞倍增时间缩短(P<0.05),增殖能力增加;细胞迁移实验显示pLV-catenin-RFP组使细胞迁移能力增加(P<0.01)。结果可见慢病毒介导稳定过表达β-catenin基因能使间充质干细胞的增殖能力及迁移能力增强。     

慢病毒介导RNAi干扰β-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

本研究通过构建β-连环蛋白（β-catenin）特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt／β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞（MSC）生物学行为的影响。设计3对针对β-cateninmRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin／shRNAl,PLB-β-catenin／shRNA2和PLB-β-catenin／shR-NA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染Msc细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Westernblot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率最高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V／7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力。结果表明：构建的特异性慢病毒siRNA干扰组（PLB-β-catenin／shRNA2）能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组（PLBgroup）和正常对照组（controlgroup）细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异（P〉0．05）;流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异（P〉0．05）;细胞划痕和Tran-swell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化。结论：构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响。     

激活Wnt信号通路阻滞沉默ZEB2对结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用

目的研究下调结直肠癌细胞中E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)的表达对细胞增殖的影响。方法 ZEB2 shRNA组、ZEB2 shRNA+氯化锂(LiCl)组细胞用感染ZEB2 shRNA慢病毒之后的SW48细胞,shRNA-NC组细胞用感染shRNA-control慢病毒之后的SW48细胞,ZEB2 shRNA+Li Cl组细胞在实验开始时在细胞培养液中添加20 mmol/L的Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl。对照组细胞不作任何处理。以实时荧光PCR和Western blot检测结肠细胞中ZEB2的表达水平。用Western blot法测定下调ZEB2后的结直肠癌细胞中Wnt信号通路蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc表达水平。用Wnt信号通路激活剂处理下调ZEB2后的结直肠癌细胞,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白剪切型Caspase-9(c-caspase-9)、剪切型Caspase-3(ccaspase-3)水平。结果 ZEB2在结直肠癌细胞中的表达水平高于正常结肠细胞。ZEB2 shRNA慢病毒感染可以下调结直肠癌细胞中ZEB2的表达。沉默ZEB2后的结直肠癌细胞的增殖能力降低,细胞凋亡增多,细胞中c-caspase-9、c-caspase-3蛋白水平升高,β-catenin、c-Myc蛋白水平降低。Wnt信号通路激活剂可以逆转沉默ZEB2后结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用。结论沉默ZEB2诱导结直肠癌细胞凋亡并抑制细胞增殖,而Wnt信号通路激活剂可以逆转沉默ZEB2的这种作用。     

miR-145抑制肺腺癌细胞A549中MMP2的表达

目的探讨miR-145对肺腺癌细胞系A549中MMP2表达的影响及其机制。方法脂质体2000介导miR-145模拟物转染肺腺癌细胞系A549,实时荧光定量PCR检测miR-145表达水平;western blot检测MMP2与β-catenin蛋白的表达水平。以wnt/β-catenin通路激活剂Li Cl与miR-145模拟物共同作用A549细胞,western blot检测MMP2和β-catenin蛋白的表达水平。结果实时荧光定量PCR结果表明,miR-145在模拟物组、对照组及空白组间的差异有统计学意义(F=296.30,P<0.05)。western blot结果显示,与对照组相比,miR-145转染后MMP2和胞核β-catenin蛋白的表达水平均明显下调(q分别为8.98,26.59,P均<0.05)。共处理实验结果表明,激活wnt/β-catenin通路能拮抗miR-145对MMP2表达的抑制作用(q=49.47,P<0.05)。结论 miR-145通过抑制wnt/β-catenin通路下调肺腺癌细胞A549中MMP2的表达。     

以RNAi慢病毒为载体下调CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响

目的:分析以RNAi慢病毒为载体下调CD59基因表达对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响。方法:通过RNAi慢病毒作为载体,诱导急性T系白血病Jurkat细胞株中的CD59表达降低;采用激光共聚焦技术分析RNAi慢病毒转染情况和CD59分子的定位情况;应用实时荧光定量PCR法检测空白对照组、阴性对照组和RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA的相对表达量;用酶联免疫吸附试验法测定3组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和白介素-3(IL-3)的表达,用免疫印迹法(Western blot)测定3组细胞中凋亡相关分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、生存素(Survivin)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)及BCL-2相关X蛋白(BAX)蛋白表达水平。结果:Jurkat细胞转染效率高于90%,CD59主要定位于细胞膜中。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA表达明显下调(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组中CD59蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低(P 0. 05)。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中TNF-β表达水平明显升高,IL-3表达水平明显降低(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组Survivin和BCL-2表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低,Caspase-3和BAX蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显升高(P 0. 05)。结论:通过转染RNAi慢病毒载体促使CD59基因表达下调可降低急性T系白血病Jurkat细胞株中促增殖分化相关分子IL-3的表达,提高肿瘤坏死相关因子TNF-β的表达,同时可提高细胞中促凋亡相关蛋白Caspase-3和BAX的表达,降低抗凋亡蛋白Survivin和BCL-2的表达。     

黄芪总皂甙对Wnt/β-catenin信号通路及神经干细胞分化的影响

目的观察黄芪总皂甙(TSA)调控体外培养大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元方向分化的作用及其有效浓度,并研究其Wnt/β-catenin信号通路相关机制。方法新生24 h大鼠大脑皮层来源NSCs进行原代、传代培养并鉴定,通过CCK-8试剂盒初筛TSA诱导分化的可能有效浓度。取第三代NSCs,设不加TSA的正常组和不同浓度TSA实验组,分化培养7 d后,间接免疫荧光法和Western blotting检测微管相关蛋白2 (MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。另设正常组、最佳浓度TSA组、TSA+Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001组和ICG-001组,分化培养7 d后,Western blotting检测各组Wnt3/3a、β-catenin和抗神经原素1 (Ngn1)蛋白表达。结果 TSA在浓度1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L时,NSCs数量显著增加(P 0.001)。TSA能增加NSCs分化为神经元的比例,1×10-5mol/L最佳(P 0.05)。TSA能上调Wnt3/3a、β-catenin与Ngn1蛋白的表达(P 0.05)。结论 TSA能促进体外培养NSCs向神经元方向分化,与激活Wnt/β-catenin信号通路,从而调控该通路下游促分化靶向蛋白Ngn1的表达有关。TSA最佳促神经元方向分化浓度约为1×10-5mol/L。     

DAPT对肺成纤维细胞表型转化中Wnt信号通路的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路与Notch信号通路之间存在间接或直接的相互作用以及该信号通路在DAPT抑制肺成纤维细胞增殖中的作用表达.方法:通过使用TGF-β1刺激SD大鼠胚肺成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞,并采用DAPT抑制Wnt/β-catenin信号通路,体外纯化肺成纤维细胞,使用细胞免疫荧光检测波形蛋白进行鉴定;分别采用5 ng/mL TGF-β1和500 nmol/L的DAPT作用于肺成纤维细胞24 h,观察其形态学改变;分别采用RT-PCR及Western blot检测wnt1、β-catenin在肺成纤维细胞经TGF-β及DAPT作用24 h后的表达情况.结果:与正常组相比较TGF-B1能显著增加肺成纤维细胞中β-catenin的表达(P＜0.05),但加用DAPT后wnt1及β-catenin在肺成纤维细胞中的表达下降(P＜0.05).结论:Wnt/β-catenin信号通路与Notch信号通路之间是存在相互关系的,TGF-β1可使肺成纤维细胞中的β-catenin表达增高;DAPT对于抑制肺成纤维细胞中的wnt/β-catenin信号通路发挥了作用.     

以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染类风湿关节炎患者软骨细胞对aggrecanase-2 mRNA表达的干扰作用

目的研究以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染类风湿关节炎(RA)患者软骨细胞对aggrecanase-2 mRNA表达的干扰作用。方法回顾性分析2015~2016年确诊为活动期或者是中晚期的RA患者30例,并在关节置换术中切除患者膝关节的软骨块,冲洗软骨块,并使用0.25%胰酶和0.20%的Ⅱ型胶原酶模拟体温在36.8℃的恒温水浴箱内让其自行消化25~35 min,离心,取其沉淀并加入一定量的10.00%胎牛血清的DMEM培养基内培养,最终取其培养的第2~3代软骨组织。将设计好的慢病毒载体介导的aggrecanase-2 shRNA转染进RA患者的软骨细胞中。按照慢病毒剂量,将细胞分为200μl(A组)、100μl(B组)、50μl(C组)。其中,A组分为空白对照组、阴性对照组、aggrecanase-2 shRNA1组(shRNA1组)、aggrecanase-2 shRNA2组(shRNA2组)、aggrecanase-2 shRNA3组(shRNA3组)、aggrecanase-2 shRNA4组(shRNA4组)。各孔加入促转染剂约3~7μm/ml,其中阴性对照为含杂乱序列的病毒液,空白对照组则用培养基来代替病毒。利用PCR技术定量检测转染之后由各种转染复数转染的aggrecanase-2和aggrecanase mRNA在各种的时间段内的表达系数。结果加入慢病毒之后的A、B、C三组RA患者的感染复数分别为100、50、25,转染效率分别为91.21%、59.98%、31.09%。以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染的RA患者的软骨细胞的aggrecanase-2 mRNA的表达水平明显有所降低,差异具有统计学意义(P0.05)。随着时间的增加,各组aggrecan蛋白表达水平出现明显的变化,其中shRNA4组升高最为明显,差异具有统计学意义(P0.05)。结论以慢病毒为载体介导的aggrecanase-2 shRNA转染的RA患者的软骨细胞中的aggrecanase-2 mRNA的表达受到明显的抑制,但是其对RA患者的软骨组织没有实质上和功能上的伤害;同时其还可以通过抑制aggrecanase-2 mRNA的表达来促进aggrecan蛋白的表达,从而起到保护软骨组织退化的作用。     

HMGA2shRNA真核表达载体转染胃癌MKN45细胞株的沉默作用

目的:将HMGA2shRNA真核表达载体转染至胃癌细胞MKN45,检测其HMGA2mRNA及蛋白的表达.方法:实验分3组:空白组(未转染的胃癌细胞)、实验组(转染HMGA2shRNA组)、阴性对照组(转染错义序列组),RT-PCR和Western blot分别检测HMGA2在mRNA及蛋白水平的变化.结果:与空白组和阴性对照组相比,实验组HMGA2mRNA的表达明显下降,差异具有统计学意义(均P＜0.05);HMGA2蛋白表达的变化与基因的变化相一致,实验组的蛋白表达明显受抑制,差异具有统计学意义(均P＜ 0.05).结论:HMGA2的特异性shRNA表达载体抑制了HMGA2的表达,HMGA2shRNA转染有望用于胃癌的基因治疗,为进一步研究其更多功能打下基础.     

shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt /mTOR信号通路的影响。方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2 mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化。结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和Neg shRNA组(30.37±4.22)%vs(1.36±0.52)%和(2.17±1.43)%(P0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt /mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调。结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3K36me2水平变化,特异性地抑制Akt /mTOR信号通路的活性。     

Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

目的观察I型人类免疫缺陷病毒蛋白R(Viral protein R、Vpr)在体外对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及探索Vpr对HT-29细胞存活素(Survivin)表达的调节作用。方法应用腺病毒转染系统将Vpr基因以不同感染复数转染至HT-29细胞。MTT法检测Vpr对HT-29细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(western blot)法检测mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表达。结果实验组可见Vpr蛋白的表达;实验组大肠癌细胞HT-29增殖受到抑制(MOI=200),从转染72h开始,实验组MTT值与对照组及空载体组比较差异均具有有统计学意义(P0.05),随着时间的延长,抑制逐渐增强;转染72h后(MOI=200),实验组细胞凋亡率与对照组及空载体组比较均差异具有显著统计学意义(P0.01);实验组处于G2/M期细胞比例与对照组及空载体组比较均差异具有统计学意义(P0.05);转染72h后,实验组(MOI=50)Survivin基因的mRNA水平及蛋白表达水平与对照组及空载体组(MOI=200)比较均差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),并且survivin的表达随着MOI的增加而减弱。结论 Vpr体外可以诱导细胞HT-29G2/M期阻滞及凋亡从而有效抑制细胞HT-29增殖,其机制可能与Vpr下调Survivin基因的表达有关。Vpr在大肠癌的治疗中具有潜在的应用前景。     

CyclinD1基因过表达慢病毒载体的构建和对神经干细胞增殖的影响

目的:针对小鼠cyclinD1基因构建质粒并进行慢病毒包装,转染小鼠神经干细胞,检测其表达水平。方法:根据cyclinD1基因信息,采用DNA重组技术将Nestin promoter-Ccnd1基因插入plenti6慢病毒表达载体,重组获得慢病毒载体plenti-D1;经测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,并检测病毒滴度。设立空白对照组、阴性病毒对照组及过表达慢病毒感染组。将病毒转染小鼠胚胎神经干细胞,经实时荧光定量PCR和western blot法分析转染前后3组cyclinD1表达情况,MTT法检测不同MOI值对神经干细胞增殖的影响。结果:测序结果证实cyclinD1基因正确插入载体中,成功构建小鼠cyclinD1基因过表达载体。实时荧光定量PCR结果显示过表达慢病毒感染组cyclinD1 mRNA较其他2组明显升高;Western Blot鉴定cyclinD1蛋白表达成功。plenti-D1的MOI值为10、20、50时均明显促进神经干细胞增殖。结论:cyclinD1基因慢病毒表达载体能感染小鼠胚胎神经干细胞,外源基因稳定表达。cyclinD1基因过表达能促进神经干细胞的增殖。     

wnt/β-catenin信号通路相关蛋白在卵巢癌中的改变

wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展中的作用已成为近年来研究的热点。wnt/β-catenin信号通路可以调控卵巢细胞的增殖、分化及恶性转化,由此介导肿瘤的发生和发展。研究显示,细胞膜上、胞质胞核内、细胞间及细胞外影响wnt/β-catenin通路蛋白的改变在卵巢癌形成中起重要作用。我们需要研究出更多在wnt/β-catenin通路中起关键作用的蛋白,并以此为靶标进行卵巢癌的治疗,将有助于研发出更加有效的治疗方案。     

β-catenin特异性抑制剂XAV939对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制的实验研究

目的:通过短发夹RNA(shRNA)干扰β-catenin基因的表达及使用β-catenin特异性抑制剂XAV939作用于套细胞淋巴瘤(MCL)Jeko-1细胞株,了解特异性抑制β-catenin活性对Jeko-1细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法:将构建β-catenin shRNA真核表达载体转染Jeko-1细胞,应用RT-PCR和Western blot的方法鉴定干扰效果,用不同浓度XAV939处理MCL细胞株Jeko-1;应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Cyclin D1、C-MYC、caspase-3表达水平的变化。结果:shRNA转染48 h后,RTPCR、Western blot检测发现,Jeko-1细胞的β-catenin的mRNA、蛋白表达下降;无论使用shRNA或抑制剂处理,均可抑制Jeko-1细胞增殖,促进其凋亡;Western blot检测显示,凋亡相关蛋白BCL-2、Cyclin D1、C-MYC的表达下降,而BAX、caspase-3表达上升。结论:特异性抑制β-catenin活性能有效地抑制Jeko-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

FH535抑制人肝癌细胞HepG2增殖及cyclin D表达

目的 探讨β-catenin抑制剂FH535对人肝癌细胞系HepG2增殖的影响及可能机制.方法 HepG2细胞分为对照组和FH535用药组,使用改良3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTS)检测FH535对HepG2细胞增殖的影响,以Western blot法检测HepG2细胞β-catenin以及cyclin D蛋白表达水平,用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测HepG2细胞cyclin D mRNA水平.结果 FH535能够显著抑制HepG2细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性.与对照组相比,FH535给药组HepG2细胞内β-catenin蛋白表达无差异.FH535给药组细胞wnt/β-catenin信号通路的靶基因cyclin D的mRNA和蛋白的表达显著下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.0001).结论 FH535通过抑制cyclin D mRNA及cyclin D蛋白表达而抑制HepG2细胞增殖.     

慢病毒介导的IGF-1R基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响。方法设计并筛选高效特异性胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,观察其转染沉默IGF-1R基因的肝癌细胞株Huh7细胞增殖、迁移以及侵袭能力,进一步观察其对PI3K/Akt及Bax/Bcl-2通路的影响。结果采用倒置相差荧光显微镜观察转染效果,镜下可见较多细胞特异性表达GFP绿色荧光,转染率超过80%。scrambled阴性对照组以及空白对照组IGF-1R mRNA及蛋白的相对表达量显著高于LV-IGF-1R-RNAi转染组(P0.01)。成功转染后,培养细胞72 h、96 h,LV-IGF-1R-RNAi转染组增值率显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05或P0.01)。侵袭实验和迁移实验均证实细胞明显受到抑制(P0.01)。蛋白免疫印迹法显示,LV-IGF-1R-RNAi转染组p-PI3K、p-Akt及Bcl-2相对表达量显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05);而Bax显著高于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05)。结论RNAi技术沉默IGF-1R基因表达能显著抑制肝癌细胞株Huh7细胞的增殖、侵袭作用,而这一作用可能与抑制PI3K/Akt通路蛋白磷酸化及调节Bax/Bcl-2通路蛋白表达有关。     

过表达lncRNA-p21通过介导Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌MGC-803细胞的生长与转移

目的:探讨lncRNA-p21在调控胃癌MGC-803细胞生长与转移作用中的作用及Wnt/β-catenin信号通路在其中的功能。方法:在人胃癌MGC-803细胞中转染慢病毒以过表达lncRNA-p21。观察细胞形态、细胞增殖以及体内外迁移和侵袭能力,检测Wnt/β-catenin信号通路是否参与lncRNA-p21介导的抑制胃癌细胞增殖和生长作用。最后使用LiCl对Wnt/β-catenin信号通路进行验证。结果:LncRNA-p21过表达的胃癌MGC-803细胞发生了形态学的改变,表现为由纺锤状或星状形态变为较圆的低侵袭状态。LncRNA-p21在体内外均抑制了胃癌MGC-803细胞增殖和生长,体外实验表现为lncRNA-p21过表达减弱了胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭能力。LiCl实验验证了Wnt/β-catenin信号通路介导了lncRNA-p21对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。结论:LncRNA-p21可在体内外显著抑制胃癌MGC-803细胞的生长与转移,且该抑制作用可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导。     

miR-21在前列腺癌中的表达及抑制其表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨抑制前列腺癌细胞中miR-21基因表达对癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 RTPCR检测前列腺癌及癌旁组织中miR-21基因的mRNA表达;空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和miR-21 inhibitor组转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后RT-PCR检测各组细胞中miR-21基因的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果前列腺癌组织中miR-21的mRNA表达显著高于癌旁组织(P0.01);转染miR-21 inhibitor后miR-21的表达显著降低;NC组细胞存活率、细胞凋亡率及ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组,差异无统计学意义(P0.05),miR-21 inhibitor组细胞存活率及ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P0.01)。结论抑制前列腺癌细胞中miR-21基因的表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

靶向沉默c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制

目的探讨抑制c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR及Western blot分别检测膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达;si-c-FLIPs转染人膀胱癌T24细胞,同时转染正常对照组(normal)和阴性对照组(si-control),48 h后Western blot检测c-FLIPs、Cleaved caspase 8、β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)蛋白表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达均显著高于癌旁组织(P0.01)。T24细胞中c-FLIPs基因的表达最高,选择作为研究对象;转染si-c-FLIPs后FLIPs的表达显著降低;si-c-FLIPs组细胞存活率及β-catenin和Cyclin D1蛋白表达显著低于normal组,细胞凋亡率及Cleaved caspase 8蛋白表达显著高于normal组(P0.01)。结论抑制膀胱癌中c-FLIPs基因表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞的凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

shRNA介导BTLA基因沉默对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

目的 探讨RNA干扰负性共刺激分子B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)表达后小鼠淋巴细胞增殖的变化.方法 构建小鼠BTLA基因小发夹RNA(shRNA)质粒载体pSiencer 3.1-BTLA/shRNA,与H1启动子共同亚克隆至慢病毒载体pLB,包装病毒后转导小鼠脾淋巴细胞,流式细胞术(FCM)检测感染效率及BTLA分子表达水平.以刀豆蛋白A(ConA)及抗CD3单抗刺激BTLA shRNA干扰组为实验组,以未行基因沉默组为对照组,CCK-8法测定各组淋巴细胞增殖水平.结果 成功构建3个pLB-BTLA shRNA慢病毒干扰载体和一个非特异性shRNA载体,并制备高滴度病毒.特异性shRNA干扰组BTLA表达水平较对照组明显降低(约40%).抗CD3单抗刺激BTLA shRNA转染的淋巴细胞后增殖水平(A450值)显著增高(3.80±0.58),与未转染shRNA对照组(2.42±0.72)相比差异有统计学意义(P＜0.05),而ConA刺激后细胞增殖水平shRNA转染组与未转染组相比差异无统计学意义(P＞0.05);组间相比,BTLA基因沉默的小鼠脾淋巴细胞经抗CD3单抗处理后细胞增殖水平较ConA处理组明显增高(P＜0.05).结论 慢病毒载体携带的特异性shRNA可有效干扰小鼠脾淋巴细胞BTLA基因的表达,BTLA基因沉默对淋巴细胞增殖具有促进作用.