SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Veto细胞中的表达

目的 构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体，并将其置于Vero细胞中表达。方法 设计1对PCR引物，在其下游引入Flag序列。通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出s蛋白编码基因，PCR产物经酶切后，插入表达载体peDNA3．1（＋）中，构建重组表达质粒peDNA3．1（＋）-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞，用抗Flag单克隆抗体通过Westernblot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果 酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确；Western blot证实重组S蛋白片段能够在Veto细胞表达。结论 融合Flag序列的SAPS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

TMSG-1蛋白不同功能域重组质粒构建及亚细胞定位

目的构建肿瘤转移抑制基因-1（TMSG-1）蛋白不同功能域重组质粒,并观察其亚细胞定位,探讨TMSG-1蛋白的转录活性。方法以pcDNA3-TMSG-1真核表达载体为模板,聚合酶链式反应（PCR）扩增TMSG-1基因全长及不同截短体片段,与带有Flag标签的真核表达载体pcDNA3连接,转化感受态细胞,氨苄青霉素筛选阳性克隆,提取质粒,酶切鉴定。用构建的TMSG-1基因各个截短片段的重组质粒转染Hela细胞,Western blot法鉴定蛋白表达。免疫荧光检测各个截短体亚细胞定位。结果 PCR成功扩增得到目的基因片段,并构建得到TMSG-1全长及不同截短片段T1（aa129-aa380）、T2（aa71-aa380）、T3（aa1-aa128）、T4（aa1-aa70）、T5（aa71-aa128）的真核表达载体,经酶切及基因测序鉴定序列完全正确。Western blot检测结果表明各重组质粒有预期长度的蛋白表达。免疫荧光检测结果表明,含有Homeodomain结构域的截短体T2、T3及T5能够入核,其中T2在核内弥漫分布,T3及T5主要定位于核仁。结论成功构建并表达了TMSG-1全长及不同截短片段的真核表达质粒,其中含有Homeodomain结构域的截短体定位于细胞核。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定。方法用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+)载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+)-HBx。以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。结果 pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+)-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

大鼠膜联蛋白A_2真核表达载体的构建及表达

目的:克隆大鼠背根神经节膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建真核表达载体并检测其表达。方法:以RT-PCR法扩增大鼠背根神经节(DRG)细胞中膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建pGMT-Anxa2克隆载体,以此为模板插入flag标签扩增Anxa2-flag序列,将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),获得表达载体pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag。以PCR、双酶切及序列测定法鉴定该质粒。以脂质体法将表达载体转染到HEK293细胞中,Western印迹和细胞免疫荧光检测annexin Ⅱ蛋白表达及细胞内定位。结果:PCR扩增Anxa2-flag片段大小与预期相同。通过PCR、HindⅢ和NotⅠ双酶切及测序鉴定,证明构建出了含大鼠annexin Ⅱ基因的真核表达载体。Western印迹和细胞免疫荧光的检测表明大鼠annexin Ⅱ基因稳定表达,并可在胞膜和胞质中广泛表达。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag真核表达载体,并稳定表达蛋白,为研究annexin Ⅱ调控DRG伤害性感受传导的分子机制奠定基础。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

小鼠分泌型内皮抑素原核表达载体pFLAG—ssEndostatin的构建

目的构建带有小鼠分泌型内皮抑素（ssEndostafin）的原核表达载体pFLAG-ssEndostatin。方法利用分子生物学方法，采用KpnI内切酶将ssEndostatin从pcDNA3．1-Egrl—ssEndostatin质粒上切下，然后连接到pFLAG表达载体上，构建成原核表达载体pFLAG-ssEndostatin，并对其进行PCR、酶切鉴定。结果经酶切、PCR鉴定，所构建的原核表达质粒pFLAG-ssEndostatin与预测的一致。结论成功地构建了带有分泌信号的内皮抑素原核表达载体pFLAG-ssEndo—statin，为进一步研究Endostatin在肿瘤治疗方面的作用奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

小鼠分泌型γ干扰素原核表达载体pFLAG—IFN-γ的构建

目的构建小鼠分泌型γ干扰素（IFN-γ）原核表达载体pFLAG-IFN-γ。方法利用分子生物学方法,从peD—NA3．1-Egr1-IFN-γ质粒上将IFN-γ切下,然后连接到原核表达载体pFLAG-shift12^TM上,构建成pFLAG-IFN-γ表达载体,进行PCR、酶切鉴定。结果经鉴定,所构建的质粒pFLAG-IFN-γ的鉴定结果与预期的一致。结论成功地构建了带有分泌信号的原核表达载体pFLAG-IFN-γ。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论：RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究

为了构建负载CML28的核酸疫苗，并在树突状细胞中进行表达，用分子克隆的方法，从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长，将其亚克隆至pGEM—T载体，经测序后酶切，克隆至真核表达载体pcDNA3．1HisA，将重组质粒pcDNA3．1HisA—CML28进行酶切分析和测序鉴定；从正常人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），在IL-4和GM—CSF条件下诱导分化为树突状细胞（DC），并进行鉴定；用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28导入到DC中，Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达。结果表明：经酶切分析和测序鉴定，重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28含有正确的CML28全长序列；经电穿孔导入Dc后，重组质粒能表达His—CML28蛋白。结论：成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗。     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。