靶向IL-11Rα的双标造影剂在乳腺癌成像中的实验研究

目的:对乳腺癌中IL-11Rα的表达进行非损伤性评价,探讨靶向IL-11Rα的双标造影剂在小鼠种植瘤模型中成像的特异性。方法:采用化学合成的方法合成IL-11的模拟物环九肽,并将其与与近红外染料或近红外/核素染料偶联,进而得到近红外或近红外/核素标记的靶向IL-11Rα的特异性造影剂;首先进行乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外结合试验;然后通过建立乳腺癌裸鼠的异体移植瘤模型,进行体内光学成像以及核素成像试验,证实获得的成像化合物在体内试验中的特异性;分析证实获得的成像化合物在体内试验中的特异性;最后病理学检测裸鼠肿瘤标本。结果:体外细胞结合试验证明合成的近红外造影剂能够很好地与人乳腺癌细胞MDA-MB-231相结合。近红外光学成像和核成像均显示了肿瘤的高信号强度,光学成像与核成像结果一致。病理学分析结果证实光学信号较强的组织为乳腺癌组织。结论:靶向IL-11Rα的特异性造影剂可与IL-11Rα阳性的乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性结合,并在裸鼠乳腺癌种植模型中进一步证明造影剂在体内成像中的肿瘤特异性,有望为临床肿瘤的早期分子诊断和靶向性治疗提供新的理论基础。     

人存活素特异性siRNA促进SOSP-9607细胞凋亡的实验研究

目的:构建人存活素(survivin)基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞SOSP-9607凋亡的影响.方法:利用pSilencer 3.0-H1 neo,构建人存活素特异性的RNA干涉载体,转染SOSP-9607细胞,G418筛选稳定转染的细胞系.westem blot检测survlvin蛋白水平变化.透射电镜等形态学观察、Annexin V法、Hoechst染色检测细胞凋亡.结果:成功构建了人存活素基因siRNA真核表达载体PS.获得了稳定转染的细胞系.与正常SOSP-9607细胞、阴性对照细胞相比,SOSP-9607/PS生长曲线十分平缓,存在显著差异(P＜0.01).western blot显示SOSP-9607/PS细胞中蛋白表达减少.SOSP-9607/PS凋亡率增加(P＜0.01).结论:特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在SOSP-9607细胞中的表达并明显促进细胞凋亡,这为进一步研究survivin在SOSP-9607细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭

目的:观察FBW7在骨肉瘤细胞SOSP-9607中的表达,探讨FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭的作用以及与Notch信号通路的关系。方法:培养人骨肉瘤SOSP-9607细胞,用慢病毒介导的siRNA转染SOSP-9607细胞,并分为sh-FBW7组（下调FBW7）、up-FBW7组（上调FBW7）和空白对照组。利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印记法（Western blot）验证分析骨肉瘤细胞系SOSP-9607和正常成骨细胞系hFOB中FBW7 mRNA表达和蛋白表达水平。Transwell实验验证FBW7对骨肉瘤细胞迁移与侵袭作用的影响。 Western blot验证FBW7与Notch信号通路的关系。结果:qRT-PCR和Western blot检测结果显示:骨肉瘤细胞系SOSP-9607中FBW7 mRNA表达和蛋白表达明显低于正常成骨细胞系hFOB（P＜0.05）。Transwell结果显示:sh-FBW7组的迁移与侵袭细胞数明显高于空白对照组（P＜0.05）;up-FBW7组的迁移与侵袭细胞数明显低于空白对照组（P＜0.05）。上调骨肉瘤细胞中的FBW7可以抑制Notch1及其靶基因Hes1的表达;下调骨肉瘤细胞中的FBW7可以增加Notch1及其靶基因Hes1的表达。结论:FBW7在骨肉瘤SOSP-9607细胞中低表达,FBW7通过Notch信号通路影响骨肉瘤SOSP-9607细胞迁移与侵袭。     

小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响

目的：研究小干扰RNA（siRNA）对骨肉瘤细胞株中趋化因子受体CXCR4基因表达和侵袭力的影响。方法：采用单细胞克隆技术，从人骨肉瘤细胞系MG-63中分离培养出高表达CXCR4的骨肉瘤细胞株，设计合成针对CXCR4基因的siRNA，脂质体法转染骨肉瘤细胞株后用RT—PCR检测CXCR4基因表达水平的变化，荧光检测转染效率，Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化。结果：转染效率约为43．82％，CXCR4编码基因序列特异性siRNA能有效下调CXCR4基因表达水平，与空白组和阴性对照组比较，其差异有统计学意义（P〈0．05），细胞株穿过侵袭膜的细胞数也较转染前减少（P〈0．05）。结论：小分子干扰RNA技术能有效抑制骨肉瘤细胞株CXCR4基因的表达和体外侵袭能力。     

人miR-34a真核表达载体的构建及其表达

目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达.方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a.pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSp-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系.结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的：观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法：采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果：转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞（凋亡率为6%）相比,其凋亡率为35.8%。结论：tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

热休克蛋白90阻止剂增强热诱导骨肉瘤细胞杀伤的研究

目的：探讨热休克蛋白90（heat shock protain 90，HSP90）分子伴侣复合物阻止剂17-丙烯胺基-17去甲氧基格尔德霉素（17-allylamide-17-demethoxgeldanamycin，17-AAG），对热诱导的骨肉瘤SOSP-9607细胞杀伤作用的影响。方法：采用干细胞集落形成实验、流式细胞术（flow cytometry，FCM）和吖啶橙荧光染色等方法观察比较单纯热疗组与热疗联合17-AAG治疗组对骨肉瘤SOSP-9607细胞活力、凋亡率及形态学影响。结果：干细胞集落形成实验显示，热疗联合17-AAG治疗组较单独热疗对骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤效应明显增强，P=0．036；Annexin V—FITC染色流式细胞术结果显示，热疗联合17-AAG治疗组所致凋亡率（52．2％）大于单纯热疗组（17．5％）；用吖啶橙荧光染色法观察到热疗联合17-AAG治疗组明显见骨肉瘤SOSP-9607细胞固缩着色不均而且较深，细胞核浓缩、裂解等凋亡特征。结论：HSP90分子伴侣复合物阻止剂17-AAG能增强热诱导的骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤作用。     

成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系.本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证.方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200 nt),多聚腺苷酸化和5'连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR 4-TOPO载体上得到大约109 bp DNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况.根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证.结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166).选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达.结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系.     

骨肉瘤细胞株CXCR4表达与细胞体外侵袭能力的相关性

目的:探讨趋化因子受体CXCR4的表达水平对骨肉瘤细胞株体外侵袭能力的影响.方法:通过单细胞克隆技术,从人骨肉瘤细胞系MG63中获取2株CXCR4不同表达水平的细胞株,免疫组化和RT-PCR检测CXCR4的表达水平,Tran-swell趋化侵袭实验观察不同细胞株趋化侵袭能力的差异,并用CXCR4单克隆抗体对高表达CXCR4的细胞株进行趋化干预.结果:CXCR4蛋白在B8和G5细胞株的表达分别为94.74±17.35和41.86±6.54,CXCR4 mRNA在B8和G5细胞株的表达分别为1.37±0.36和0.44±0.13,差异均有统计学意义,P<0.05.B8细胞株的体外趋化侵袭能力(53.60±15.37)明显强于G5细胞株(19.60±8.20).与CXCR4的表达呈正相关,P值均<0.05.单克隆抗体干预组的侵袭细胞数(21.80±8.53)明显小于未干预组(53.60±15.37),P<0.05.结论:骨肉瘤细胞株高度的体外侵袭能力与CXCR4高表达密切相关并能被特异性抗体抑制.     

骨肉瘤血行转移与CXCR4、VEGF相关性研究

背景与目的:细胞趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在肿瘤转移中起重要作用,在某些肿瘤中,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可调节CXCR4的表达以此调节肿瘤侵袭力。本研究在于探讨趋化因子受体CXCR4和VEGF在骨肉瘤组织中的表达及其与血行转移的相关性。方法:应用组织芯片技术检测56例骨肉瘤组织中CXCR4和VEGF表达,分析CXCR4与VEGF之间的相关性及两者与碱性磷酸酶(ALP)、分期等临床特征的相关性,并随访其术后2年内远处血行转移的情况。结果:56例骨肉瘤组织中CXCR4与VEGF表达相关(r=5.678,P=0.02)。单因素分析显示年龄、性别、ALP水平升高与CXCR4、VEGF表达无关,而临床分期与CXCR4、VEGF的表达相关(P=0.026)。56例随访2年内发生远处转移31例,且CXCR4、VEGF表达均与远处转移相关(P值分别为0.018、0.022)。结论:VEGF是骨肉瘤血管生成过程中最重要的正向调节因子,并可能通过调节CXCR4的表达,促进肿瘤细胞向特异性靶器官迁移;CXCR4和VEGF表达可作为骨肉瘤预测血行转移的指标。     

胸大肌瓣加原位皮片移植修复鼻咽癌放疗后颈部复发的术后缺损

目的:胸大肌皮瓣是头颈部术后缺损常用的修复皮瓣,但由于它的臃肿常导致术后较高的并发症发生。本文将介绍我院采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮在鼻咽癌放疗后颈部复发术后皮肤缺损修复中的应用。方法:对2007年1月-2012年1月就诊中山大学肿瘤防治中心的8例鼻咽癌根治性放疗后颈部复发侵犯颈部皮肤及皮下组织患者,采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮修复颈部大面积皮肤及皮下组织缺损。常规取胸大肌皮瓣,切除皮瓣的皮肤及皮下脂肪,从切除的皮肤中获取表皮和真皮层植皮在胸大肌上,打包7天。结果:皮瓣大小6cm×9cm-6cm×15cm,常规测量切除的皮下脂肪厚度,平均15.13mm(n=8)。所有皮瓣及移植皮片均存活良好,所有患者对术后供区、受区外观满意。结论:本方法简便易行,创伤小,成活率高,改善胸大肌皮瓣臃肿的同时修复了颈部皮肤缺损,不仅能恢复功能,还有较好的外形。     

Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达及意义

stathmin作为细胞信号转导分子在细胞分化及恶性肿瘤发生、发展上发挥重要作用。本研究旨在探讨Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达,并探讨阻断其表达对该肿瘤细胞的生物学行为的影响。方法：RT-PCR及原位杂交法检测2个人成骨肉瘤细胞系及45例人成骨肉瘤组织中Stathmin基因表达情况;以高表达Stathmin基因的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为靶细胞、反义Stathmin(ASODN)为阻断剂,通过MTT实验观察ASODN对该细胞系的生长抑制作用,并用流式细胞仪分析其对细胞增殖周期的影响。     

原位红色荧光标记骨肉瘤肺转移裸鼠模型的建立

目的 利用红色荧光蛋白（RFP）基因建立原位骨肉瘤肺转移裸鼠模型,为体内监测骨肉瘤的生长及抗肿瘤药物的药效评价建立一种肿瘤动物模型。方法 以包含逆转录病毒pLNCX DsRed 2的PT67包装细胞转染人骨肉瘤细胞系143B,在裸鼠胫骨近端原位接种使其成瘤,活体荧光成像系统观察骨肉瘤的生长及肺转移情况。结果 获得稳定表达红色荧光蛋白的人骨肉瘤细胞株,原位接种的肿瘤发生率达100％,肺转移率为80％。通过活体荧光成像系统于移植1周观察到肿瘤形成,移植4周肿瘤呈梭形膨胀,移植6周肿瘤呈分叶状球形,发光强度亦逐渐增加。结论 通过建立原位骨肉瘤肺转移裸鼠模型可以观察原位骨肉瘤的不同生长过程以及肺转移情况,是研究骨肉瘤生长及肺转移相关因素的一种重要工具。     

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨caspase6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法：应用RTPCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP9607中caspase6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体，构建含caspase6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染SOSP9607细胞株， 用RTPCR方法检测转染后SOSP9607细胞中caspase6基因的表达。用MTT法检测转染caspase6对SOSP9607细胞株生长的影响。结果：成骨肉瘤细胞株SOSP9607中未检出caspase6表达。RTPCR法证实转染caspase6后SOSP9607中caspase6表达显著增强，MTT检测显示对SOSP9607细胞的生长有抑制作用，形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论：caspase6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

Messenger RNA expression levels of CXCR4 correlate with metastatic behavior and outcome in patients with osteosarcoma.

PURPOSE: To determine if osteosarcoma cells express chemokine receptors and if their presence or absence relates to clinical features. EXPERIMENTAL DESIGN: Using fluorescent quantitative real-time PCR, the pattern of 17 chemokine receptors in 3 osteosarcoma cell lines and 68 osteosarcoma patient samples was analyzed. RESULTS: The expression of the chemokine receptors was generally low among the cell lines. In the high-grade osteosarcoma patient samples (n = 47), CXCR4 was the most commonly expressed (63%) and its expression level was inversely correlated to overall survival (P < 0.0001), event-free survival (P < 0.001), and metastasis-free survival (MFS; P = 0.002). There was also a correlation between the expression level of CXCR4 and the presence of metastasis at diagnosis (P = 0.002). CCR7 was expressed in 43% of the samples and its expression level was inversely correlated with overall survival (P = 0.03) and MFS (P = 0.007). CCR10 mRNA expression level was inversely correlated with MFS (P = 0.009). There was no association between the expression of CXCR4, CCR7, and CCR10. Of the 26 samples studied for stromal cell-derived factor-1 expression, 77% expressed it, but there was no correlation with the clinical variables or CXCR4 expression. Multivariate analysis revealed that mRNA expression level of CXCR4 was the only significant variable for overall survival (P = 0.0006), event-free survival (P = 0.004), and MFS (P = 0.025). CONCLUSIONS: These data suggest that CXCR4 could be useful as a prognostic factor and as a predictor of potential metastatic development in osteosarcoma. If further studies confirm that it is relevant to metastases in this disease, it could represent a new therapeutic target.     

Relationships between levels of CXCR4 and VEGF and blood-borne metastasis and survival in patients with osteosarcoma

The present study was designed to determine whether the expression of chemokine receptor CXCR4 and vascular endothelial growth factor (VEGF) is correlated with the extent of metastasis and the survival of patients with osteosarcoma. Using tissue microarrays, we analyzed the expression of CXCR4 and VEGF in tumor tissues collected from 56 patients with osteosarcoma. A two-year follow-up was performed to evaluate tumor metastatic behavior and the overall survival of the patients. There was a significant correlation between the expression of CXCR4 and the expression of VEGF in tumor tissues of these patients (P = 0.002). Univariate analysis revealed that expression of these proteins was correlated with clinical stage, but not age, gender, or serum alkaline phosphatase levels. The patients with tumors expressing CXCR4 and VEGF had worse overall survival rates compared with the patients with tumors that did not express CXCR4 (P = 0.03) or VEGF (P = 0.04). These data indicate that CXCR4 and VEGF expression is highly correlated with metastatic progression in patients with osteosarcoma and had predictive value for the metastasis and survival of osteosarcoma patients.     

CXCR4和COX-2在膀胱癌中的表达及其意义

目的：探讨COX-2和CXCR4在膀胱癌中的表达及意义。方法：应用免疫组织化学方法检测30例膀胱癌患者CXCR4、COX-2蛋白表达,分析CXCR4和COX-2的表达与膀胱癌浸润程度的关系。结果：10例正常膀胱黏膜组织中,CXCR4、COX-2蛋白阳性表达率均为20%,30例膀胱癌组织中,其CXCR4、COX-2阳性表达率分别为77.5%、80%,P〈0.01,差异有统计学意义。病变局限在黏膜层的癌组织,其CXCR4、COX-2蛋白阳性表达率分别为50%、61.1%;浸润深度达肌层组的癌组织CXCR4、COX-2蛋白阳性表达率分别为100%、95.5%,P〈0.01,差异有统计学意义。经Spearman等级相关性分析表明,CXCR4和COX-2表达水平之间成正相关关系（rs=0.477,P〈0.01）。结论：COX-2和CXCR4在浸润膀胱癌中均有较高表达,可以考虑作为膀胱癌早期的诊断、分析膀胱癌浸润程度的标志物。