靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的:探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-completion gene 1,ERCC1)逆转耐顺铂(cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法:(1)常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的ERCC1-siRNA转染细胞,转染浓度分别为100、200、300 nmol/L,并设空白转染、Lip转染对照组,观察转染效果。(2)采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测肿瘤细胞转染siRNA后ERCC1基因和蛋白的表达。(3)MTT法检测肿瘤细胞耐药指数,观察ERCC1靶向siRNA逆转A549/CDDP细胞顺铂耐药的效果。结果:(1)Lip组、siRNA-neg组转染效率分别为(56.38±9.82)%、(63.54±4.87)%,SiRNA-ERCC1①组、siRNA-ERCC1②组、siRNA-ERCC1③组转染效率分别为(43.62±6.08)%、(65.85±9.61)%和(78.93±4.86)%。(2)针对ERCC1的siRNA转染A549/CDDP后,细胞ERCC1 mRNA及蛋白表达均下调,siRNA-ERCC1(300 nmol/L)组效应最强,分别下降至(11.19±6.82)%和(20.88±6.57)%(P<0.01)。(3)A549/CDDP细胞转染后耐药倍数减为6.05、4.64、2.94,空载体对照组细胞的耐药倍数为9.6。结论:RNA干扰技术封闭ERCC1基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性,且呈一定的浓度依赖性;ERCC1基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点。     

基因在肺腺癌A549细胞中的表达及其对细胞生长的抑制

目的: 研究外源性分化抑制因子3（Inhibitor of differentiation 3,Id3）基因表达对人肺腺癌细胞系A549细胞生长的抑制作用。方法：构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP/Id3,采用脂质体转染技术将pEGFP/ Id3导入A549细胞。FCM分析转染细胞EGFP表达效率，荧光显微镜观察EGFP表达情况；半定量RTPCR、免疫细胞化学分析转染后A549细胞 Id3 mRNA和蛋白的表达。MTT法检测转染后A549细胞生长抑制情况，FCM分析A549细胞周期进程，Annexin V/7AAD和Hoechst33258染色检测转染后细胞的凋亡情况。结果:成功构建人Id3与EGFP融合基因表达载体pEGFP/Id3；荧光显微镜和FCM观察到EGFP的有效表达，转染48~72 h时EGFP表达率最高；Id3 mRNA及蛋白在转染后的A549细胞中能有效表达。转染后48 h和72 h，pEGFP/Id3转染组A549细胞生长受到明显抑制（P<0.01）；细胞周期分析表明，pEGFP/Id3转染组G0/G1期细胞显著高于对照组（P<0.05）; Annexin V/7AAD双染结果显示，pEGFP/Id3转染组细胞的早期凋亡率\[（10.67±2.60）%\]显著高于pEGFP组\[（3.39± 2.21）%\]和未转染组\[（2.35 ± 0.95）%\]（P<0.05）；Hoechst33258染色结果也证实pEGFP/Id3组A549细胞出现明显凋亡形态特征。结论:外源性Id3基因在肺腺癌A549细胞中的表达能抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

RNA干扰抑制ERCC1/ERCC2表达对非小细胞肺癌化疗敏感性影响观察

目的探讨利用RNA干扰技术沉默非小细胞肺癌A549和A549/顺铂(DDP)细胞株ERCC1和ERCC2的表达对DDP化疗敏感性的影响。方法设计并合成靶向基因siRNA-ERCC1和siRNA-ERCC2,并构建载体,通过前期转染A549/DDP细胞,筛选出沉默ERCC1和ERCC2基因表达最优的小分子RNA片段及最佳的作用时间,再将筛选出来的最优片段通过脂质体LipofectamineTM2000转染入A549细胞,观察其转染效率,使用RT-PCR及细胞免疫组化分别检测转染后基因及蛋白的表达变化;利用MTT法检测转染后细胞IC50,观察其对DDP耐药性的变化;再根据实验结果,从A549和A549/DDP细胞株中选定一株能够被逆转耐药的细胞接种于12只裸鼠皮下,观察裸鼠成瘤时间,并加用DDP局部化疗4次,记录肿瘤体积变化情况。结果通过siRNA-ERCC1和siRNA-ERCC2转染A549细胞株后,其ERCC1mRNA相对表达量为104.097 8±8.551 3,未转染组为128.465 6±12.360 4;ERCC2 mRNA相对表达量为90.415 7±7.882 1,未转染siRNA-ERCC2组为123.310 0±10.999 2。转染组的mRNA相对表达量均小于未转染组,P<0.05。转染A549细胞后,转染组ERCC1和ERCC2蛋白表达量分别为1.982 1±0.518 7和2.087 1±0.655 2,明显低于未转染组ERCC1(4.576 4±1.271 1)和ERCC2(5.680 0±1.416 7),P<0.01;MTT结果提示,siRNA-ERCC1和siRNA-ERCC2转染细胞A549后的IC50分别为(20.322 7±0.452 1)和(20.394 7±0.479 4)μg/mL,与未转染组(21.062 4±0.766 4)μg/mL差异无统计学意义,P>0.05;转染A549细胞后未发现逆转DDP耐药的效果,故筛选出A549/DDP细胞株。siRNA-ERCC1转染组的肿瘤体积为(144.63±7.67)mm3,siRNA-ERCC2转染组为(130.65±8.45)mm3,均明显小于未转染组的(252.35±12.36)mm3,P<0.01。结论高效的特异性siRNA能抑制非小细胞肺癌细胞中ERCC1和ERCC2基因和蛋白的表达,并能使A549/DDP细胞株对DDP的耐药性降低,但不能改变A549细胞株对DDP的耐药性。     

RNA干扰ERCC1基因表达对肺腺癌细胞A549/DDP顺铂耐药的影响

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)的表达可能与DDP耐药有关.本研究旨在探讨小干扰RNA沉默ERCC1基因表达对肺腺癌耐药细胞A549/DDP药物敏感性的影响.方法将体外设计合成针对ERCC1的小分子RNA(siRNA)转染A549/DDP细胞,RT-PCR检测ERCC1 mRNA水平;Western blot检测ERCC1蛋白表达的变化;MTT检测RNA干扰后细胞药物敏感性改变.结果 ERCC1 RNAi干扰后ERCC1 mRNA表达指数降低,明显低于对照组,干扰后ERCC1 mRNA表达抑制率为90.4%.转染ERCC1 siRNA降低TERCC1蛋白的表达水平.MTT显示分别用2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL顺铂处理细胞48 h,转染ERCC1 siRNA细胞组较对照组敏感性明显增高,干扰前A549/DDP细胞IC50为12.49μg/mL,干扰后A549/DDP细胞IC50下降为9.27 μg/mL.结论 ERCC1siRNA干扰可以降低ERCC1的表达水平,并可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性.     

肺癌细胞中survivin与P53的相关性

目的:观察survivin特异性小干扰 RNA (small interference RNA, siRNA)对P53野生型和P53 缺失型肺癌细胞株的生长抑制作用， 分析肺癌细胞中survivin 与 mP53的相关性 。 方法 ：以化学合成的survivin siRNA转染 P53野生型肺癌细胞株A549和P53缺失型肺癌细胞株H1299，用MTT 法检测转染前后肺癌细胞的增殖情况，流式细胞术分析细胞周期和凋亡的改变，半定量 RTPCR 检测转染对survivin mRNA表达的影响，Western blotting 检测survivin、 PARP、 P21、 P53等蛋白表达的变化。 结果：siRNA转染前A549 细胞中survivin表达量明显低于 H1299 细胞(P<0.05)。 Survivin siRNA 转染组两种细胞 survivin 蛋白及 RNA 表达水平均显著低于对照组和无关干扰组(P<0.01)。Survivin siRNA 对 A549 和 H1299细胞生长抑制作用均呈浓度依赖性(P<0.05)，但对H1299细胞的抑制起效晚于A549，且抑制程度低于A549细胞。转染后 A549和 H1299 细胞均有 G1 期比例增加和 S 期比例相应地减少，H1299 细胞的变化更为显著。 A549 细胞有一定比例出现凋亡，PARP 发生了裂解，P53、 P21蛋白表达增加，而H1299 细胞中上述指标的变化却不明显。 结论：P53野生型 A549细胞内源性survivin表达明显低于P53缺失型H1299细胞；抑制survivin能上调P53蛋白表达，其对A549细胞的生长、凋亡和P21等蛋白表达的影响明显强于H1299细胞；提示survivin与P53之间可能存在着相互抑制作用。     

siRNA与人工半合成手型多西紫杉醇对A549多药耐药细胞的协同抑制作用

目的:探讨小分子干扰RNA (siRNA)与人工半合成多西紫杉醇对人肺腺癌细胞A549耐药细胞系(A549/CDDP)的协同抑制作用.方法:采用化学合成的方法,合成手型多西紫杉醇,设计针对多药耐药基因1(MDR1)序列的siRNA,克隆入psiRNA中(psiRNA-MDR).用半合成多西紫杉醇和转染psiRNA-MDR两种方法对培养的A549/CDDP细胞和荷瘤小鼠瘤体进行处理,观察其对A549/CDDP细胞生长的抑制作用.结果:siRNA/MDR1明显抑制A549/CDDP细胞MDR1表达;半合成多西紫杉醇可增加A549细胞凋亡,对A549组细胞、A549/CDDP组细胞和A549/CDDP-psiRNA/MDR组细胞的抑制率分别为75%、39%和87%;后两组裸鼠移植瘤体积分别为(7814±1005)mm3、(6632±1203)mm3和(540±121.4)mm3,均有显著差异.结论:siRNA与人工半合成手型多西紫杉醇对多药耐药肺癌细胞有明确的协同抑制作用.     

RNA干扰GRP75表达改善人肺腺癌细胞对顺铂耐药性

背景与目的 GRP75(glucose regulated protein75)属于热休克蛋白(hot shock protein,HSP)家族,是一种主要位于线粒体的分子伴侣,在某些耐药的肿瘤细胞中高表达。本研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默GRP75基因的表达,观察下调GRP75的表达对肿瘤细胞耐药性的影响并探讨GRP75在肿瘤细胞耐药机制中的作用。方法以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的方法,诱导建立耐顺铂细胞株A549/CDDP。分别将包裹GRP75-shRNA和不含干扰序列的慢病毒转染A549和A549/CDDP细胞,在荧光显微镜下观察各组细胞转染率,应用M比色法检测干扰前后各组细胞对顺铂的敏感性,应用Western blot检测干扰前后各组细胞GRP75、p53、bcl-2的表达。结果各组细胞感染效率均在90%以上,转染后A549/CDDP和A549细胞中GRP75的表达均明显下调(P<0.05)。转染前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药指数分别为21.52和4.14。转染后A549/CDDP细胞内p53的表达上调(P<0.05),bcl-2表达下调(P<0.05)。结论 GRP75是A549细胞对顺铂耐药机制的相关蛋白之一,其在耐药机制中的作用与其对p53和bcl-2的调控有关。     

shRNA下调BAG-1表达降低肺癌A549细胞对顺铂的耐药性

目的：通过载体介导的shRNA下调BAG-1基因（Bcl-2 associated athanogene-1)表达,探讨其对肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药性的影响。方法：构建靶向BAG-1的shRNA干扰载体pGCsi-BAG-1,稳定转染A549细胞。实验组使用稳定转染pGCsi-BAG-1的细胞株（BAG-1-shRNA）,阴性对照组使用无关序列质粒转染的细胞株（SC-shRNA）,对照组使用未转染的亲本A549细胞株（Control）。Western blotting检测pGCsi-BAG-1转染对A549细胞BAG-1、Bcl-2表达的影响。MTT法、流式细胞术分别检测pGCsi-BAG-1转染对DDP处理后A549细胞的增殖和凋亡的影响。结果：成功构建稳定干扰BAG-1表达的A549细胞株,BAG-1-shRNA组细胞中BAG-1和Bcl-2蛋白表达显著低于SC-shRNA组和对照组（均P<0.05）。随DDP(25~40 μg/ml)浓度增加,各组细胞增殖抑制率也随之升高,DDP浓度为2.5 μg/ml时,BAG-1-shRNA组A549细胞的增殖抑制率即显著高于SC-shRNA组和对照组\[（22.26±4.89）% vs （10.07±3.82）%,（8.12±4.09）%,均P<0.05\]。与SC-shRNA组和对照组相比,DDP(2.5 μg/ml)处理24 h后,BAG-1-shRNA组凋亡率显著升高\[（37.8 4±3.62）％ vs （16.80±281）％、（17.10±3.11）％,P<0.05\]。结论：下调BAG-1表达可抑制DDP作用下的A549细胞的增殖并促进其凋亡。     

突变型K-ras siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移并诱导细胞凋亡

目的:构建靶向Kras的siRNA,研究Kras siRNA对Kras基因突变型肺癌细胞A549及Kras野生型小细胞肺癌细胞NCIH446生长和迁移的抑制作用。方法:设计并人工合成4条Kras siRNA（针对野生型Kras基因的Kras siRNA1~ Kras siRNA3;针对突变型Kras 基因的Kras siRNA4）,并分别转入A549和NCIH446细胞。RTPCR和Western blotting检测不同Kras siRNA对Kras mRNA和蛋白表达的影响,MTT法检测不同Kras siRNA对A549和NCIH446细胞增殖的抑制作用,Transwell实验和Hoechst 33258染色检测Kras siRNA对细胞迁移和凋亡的影响。结果:靶向突变型Kras的Kras siRNA4能特异性抑制A549细胞中Kras的表达,但对Nras和Hras的表达没有影响。Kras siRNA4抑制A549细胞的增殖,但不影响含野生型Kras基因的NCIH446细胞的增殖。Kras siRNA4还能诱导A549细胞凋亡、抑制A549细胞迁移。结论: 针对突变型Kras基因的siRNA可特异性抑制Kras突变型肺癌细胞的增殖和迁移,并诱导该细胞凋亡,Kras siRNA可望用于Kras突变型肿瘤特别是肺癌的个体化治疗。     

顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1表达的相关性研究

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达可能与DDP耐药有关。本研究的目的是证实ERCC1表达与DDP作用的关系,推测ERCC1在DDP耐药中的作用。方法选择人肺腺癌细胞A549及其耐DDP细胞株A549/DDP为研究对象,RT-PCR及免疫细胞化学方法检测不同浓度、不同作用时间DDP干预后细胞中ERCC1的表达,采用MTT法检测A549/DDP细胞耐药指数。结果10μmol/LDDP作用12h,A549细胞中ERCC1 mRNA表达开始增高,随着作用时间的延长,ERCC1 mRNA的表达逐渐增高,在72h组ERCC1 mRNA表达最强,为66.69%±5.30%。浓度为5μmol/L的DDP即可刺激A549细胞中ERCC1基因水平上升,而随着DDP浓度的增加,ERCC1 mRNA水平逐渐上升,20μmol/L组达高峰(79.50%±5.46%),为对照组的3.9倍。蛋白表达的增高趋势与mRNA基本平行,但二者幅度不完全一致。与亲本细胞比较,经长期小剂量DDP诱导的耐药株A549/DDP中ERCC1表达明显增高。结论随着小剂量DDP作用时间的延长,A549细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量增加,推测ERCC1可能参与了继发耐药的形成。     

双氢青蒿素逆转人肺腺癌细胞多药耐药作用研究

目的观察双氢青蒿素和顺铂在体外对A549及A549/CDDP细胞的作用,分析双氢青蒿素抗肺癌和逆转耐药效果。方法采用细胞计数法绘制亲代A549细胞和A549/CDDP细胞生长曲线,细胞增殖及增殖抑制实验采用MTT检测法:A549/CDDP细胞分为顺铂单药作用组,联合作用组(100nM双氢青蒿素加顺铂,320nM双氢青蒿素加顺铂),序贯治疗组(100nM双氢青蒿素预处理),用MTT检测法分析计算IC50值进行比较。结果顺铂对人肺腺癌A549细胞和A549/CDDP细胞IC50值分别为0.270μg/ml和5.703μg/ml,耐药倍数为21.12。对A549/CDDP细胞,联合治疗100nM双氢青蒿素组顺铂IC50值为2.225μg/ml(逆转倍数2.56),320nM双氢青蒿素组顺铂IC50值0.464μg/ml(逆转倍数12.29)。对A549/CDDP细胞,序贯治疗组顺铂IC50为2.523μg/ml(逆转倍数2.26)。结论联合用药和序贯治疗均可逆转A549/CDDP细胞对顺铂的耐药。     

肺癌细胞自分泌VEGF对mCRPs的调控及其机制

目的：研究人非小细胞肺癌A549细胞自分泌VEGF对膜结合补体调节蛋白(membranebounal complement regulatory proteins, mCRPs)的调控及其机制。方法: RTPCR法检测CD46、CD55、CD59、VEGF及其受体(KDR和FLT1)和 IL8及其受体(CXCR1 CXCR2) mRNA在人非小细胞肺癌A549细胞的表达。MTT法检测抗VEGF抗体和抗IL8抗体对A549细胞增殖的影响,流式细胞术检测抗VEGF抗体和抗IL8抗体对A549细胞mCRPs表达水平的影响,Western blotting检测抗VEGF抗体对转录因子KLF2和磷酸化NFκB p65蛋白表达的影响。结果：A549细胞表达膜结合型CD46、CD55和CD59 mRNA,亦表达VEGF及其受体（KDR和FLT1）和 IL8及其受体（CXCR1和CXCR2） mRNA。抗VEGF抗体明显抑制A549细胞的增殖（P<0.05）。终质量浓度0.1 μg/ml抗VEGF抗体封闭72 h,CD55和CD59 mRNA表达下降,膜结合的CD55和CD59蛋白分子表达降低(均P<0.05);胞质和核KLF2蛋白相对定量值分别从063和0.88下降至0.42和0.66,胞质和胞核磷酸化NFκB p65蛋白相对定量值分别从0.44和0.28下降至0.37和019。结论：A549细胞可能通过自分泌VEGF增加NFκB p65和KLF2转录因子水平,从而上调CD55和CD59的表达。     

不同温度热疗逆转人肺癌细胞A549/CDDP耐药性的研究

目的 探讨不同温度的热疗对人肺腺癌细胞A549/CDDP耐药逆转作用及可能机制.方法 采用体外细胞培养技术,培养人肺腺癌细胞系A549及其耐药株A549/CDDP.设计不同温度(37、40、41、42、43℃)热疗2 h,联合2μg/mL CDDP处理A549/CDDP细胞,检测其对化疗药物CDDP的敏感性,流式细胞仪间接免疫荧光法检测CDDP、热疗处理前后细胞中P-糖蛋白(P-gp)的表达及细胞内荧光药物CDDP的聚集量.结果 A549/CDDP细胞抑制率在39-42℃范围内随热疗的温度升高而升高,42℃时最高(P<0.05).热疗合用顺铂时,A549/CDDP细胞P-gP表达下降,胞浆内CDDP荧光强度增强.结论 热疗能部分逆转人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药效应,其机制可能与抑制P-gP表达,增加细胞内化疗药物积聚有关.     

基因对胃癌MGC 803细胞的抑制作用及其可能的机制

目的:研究沉默乳腺癌相关抗原1（breast cancerassociated antigen 1,BRCAA1)基因对胃癌细胞株MGC803的抑制作用及其可能的机制。方法：构建BRCAA1基因shRNA载体，将构建的shRNABRCAA1质粒与阴性对照质粒shRNAN转染胃癌MGC803细胞，24 h后用荧光显微镜观察转染效率，实时定量PCR检测 BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平。MTT法检测转染后24、48与72 h的细胞增殖水平，AnnxinV PE/7AAD检测转染24 h后的细胞凋亡水平，Western blotting检测转染48 h后细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果：BRCAA1 siRNA表达质粒转染MGC803细胞24 h 的转染效率为（81.2±2.6）％ 。转染后48 h MGC803细胞的BRCAA1 mRNA水平下降了61.4％，MGC803细胞增殖的抑制率达45.0%，转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞\[（14.4±１.6）% vs（5.4±2.0）％，（4.4±2.5）％，P<0.05\]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P<0.05），Bcl2的表达量显著减少（P<0.05）。结论：BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达有关。     

阻断表皮生长因子受体和环氧合酶-2信号途径对肺腺癌细胞的抗增殖作用

目的:探讨表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼(gefitinib)联合新型环氧合酶2（cyclooxygenase2, COX2）抑制剂塞来昔布(celecoxib)对肺腺癌A549细胞株的抑制作用及其可能机制。方法:肺腺癌A549细胞培养于RPMI 1640 培养液中,实验分为正常对照组、吉非替尼5 μmol/L组、塞来昔布25 μmol/L组、吉非替尼5 μmol/L加塞来昔布25 μmol/L组。药物干预细胞48 h后,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,锥虫蓝拒染法检测药物对细胞生长的影响,Annexin V/PI法和Hoechst33258染色法检测细胞凋亡,流式细胞术检测药物作用周期,免疫荧光和Realtime PCR法检测EGFR、COX2蛋白的表达及EGFR mRNA的表达情况。结果:吉非替尼联合塞来昔布组相比单药组,A549 细胞明显出现大量颗粒和空泡,细胞变圆并开始脱落。吉非替尼与塞来昔布单药对A549细胞抑制作用具有时间和剂量依赖性,加药48 h时吉非替尼（5 μmol/L）联合塞来昔布（25 μmol/L）组抑制率为(58.2±4.6)%,明显高于单药组（P<0.01）。联合用药组A549细胞凋亡率明显高于单独用药组（33.9% vs 6.0%,8.8%）,其S期细胞明显减少、G0/G1期明显增加（P<0.01）;EGFR、COX2蛋白的表达明显减弱（P<005）,EGFR mRNA相对表达量（028±0.05）明显高于单独用药组（P<0.05）。结论:吉非替尼和塞来昔布联合对肺腺癌A549 细胞增殖的抑制具有明显协同作用,其可能机制是诱导凋亡、增强G0/G1期阻滞和进步下调活化的EGFR与COX2的表达。     

人肺腺癌耐顺铂细胞A549/CDDP获得侵袭转移能力的分子机制

目的:研究人肺腺癌耐顺铂细胞A549/CDDP获得侵袭转移能力的分子机制。方法:细胞划痕实验和Transwell侵袭实验比较A549和A549/CDDP的转移侵袭能力的差别,以及LY294002对A549/CDDP侵袭转移能力的影响。蛋白质免疫印迹技术检测AKT,NF-κB,STAT3信号通路的激活情况,MTT法检测A549和A549/CDDP对顺铂的敏感性,以及PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性的影响。结果:A549/CDDP对顺铂的耐药性以及侵袭转移能力相对于A549有明显增强。Western blot结果表明:A549/CDDP细胞AKT通路被激活,NF-κB,STAT3通路没有明显变化。LY294002能够明显抑制A549/CDDP的侵袭转移能力并且能够提高A549/CDDP对于顺铂的敏感性。结论:A549/CDDP细胞相对于A549细胞的侵袭转移能力明显增强,其机制与PI3K/AKT信号通路的激活有关。     

重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用

目的: 探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAdE1ACDglyTK与酶前体药物5FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法: 将重组腺病毒质粒prAdE1ACDglyTK经脂质体介导转染293细胞，进行病毒的扩增、纯化与PCR鉴定，以紫外分光光度法与TCID50法测定纯化病毒的颗粒浓度与感染性滴度，计算病毒比活性；在SKOV3细胞中观察重组病毒的复制能力及感染效率，确定感染率达90%以上的最小MOI。用MTT法观察感染重组病毒的SKOV3细胞对5FC或GCV的敏感性，并计算IC50；观察一定MOI的rAdE1ACDglyTK或重组复制缺陷型腺病毒rAdCDglyTK与IC50的5FC和(或)GCV联合应用对SKOV3细胞生长的抑制作用。结果: 经PCR和琼脂糖凝胶电泳证实，纯化重组腺病毒中存在E1A和CDglyTK两个基因片段，其病毒颗粒浓度和感染性滴度分别为9.47×1011VP/ml和3.16×1010IU/ml，病毒比活性为3.34%。重组病毒可在SKOV3细胞中复制，对SKOV3细胞的感染效率随MOI的增加而增加，可致细胞感染率达90%以上的最小MOI为50 IU/cell。5FC或GCV明显抑制感染细胞的生长，且存在明显的剂量依赖效应。两种重组腺病毒/前药系统的抑瘤作用比较显示，rAdE1ACDglyTK组细胞生长抑制率\[(16.57±1.59)%\]显著高于rAdCDglyTK组\[(10.44±1.80)%，P<0.01\]；与IC50的5FC和GCV双药联合应用，其抑制率达(71.68±2.63)%，显著高于rAdCDglyTK/5FC+GCV组的(63.64±2.91)%（P<0.01）。结论: 重组腺病毒rAdE1ACDglyTK与酶前体药物联合应用对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的抑制作用，其效果优于重组复制缺陷型腺病毒rAdCDglyTK。     

siRNA对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的抑制作用

目的: 探讨VEGFR3对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的影响。方法:构建携靶向 VEGFR3基因siRNA(small interfering RNA)表达载体，转染人结肠癌LoVo细胞， 半定量RTPCR和Western blotting检测转染前后LoVo细胞VEGFR3mRNA和蛋白表达的变化，基质黏附实验检测细胞转染后的黏附能力，细胞侵袭实验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变。结果:携靶向 VEGFR3 基因siRNA的表达载体成功构建，RTPCR检测转染siRNA后LoVo细胞 VEGFR3mRNA表达水平降低；Western blotting检测转染siRNA后72 h LoVo细胞VEGFR3蛋白表达下降，其表达相对值由(1.26±0.19)降至(0.39±012)(P<0.05)。转染siRNA 72 h后LoVo细胞的黏附能力显著下降\[（0.626±0.047）vs (0.407±0.029), P＜0.05\]；LoVo细胞穿膜细胞数(6.38±3.25)明显低于空白对照组(24.82±3.44)、非特异性对照组(23.58±3.73) (P＜0.05)。结论:siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应，下调VEGFR3基因的表达，进而抑制LoVo细胞的黏附能力和侵袭性。     

双氢青蒿素和顺铂诱导人肺腺癌A549/CDDP 细胞凋亡

目的:观察双氢青蒿素和顺铂在体外对A549/CDDP细胞的作用,分析双氢青蒿素逆转耐药效果,从诱导细胞凋亡角度分析可能的作用机理。方法:A549/CDDP细胞分为双氢青蒿素作用组和顺铂对照组,顺铂对细胞增殖抑制实验采用MTT检测法,用annexin-V和PI双标记进行流式细胞检测分析细胞凋亡率。双氢青蒿素对细胞Bcl-2,Bax等蛋白的影响采用免疫组织化学法结合图像分析。结果:对人肺腺癌A549/CDDP细胞双氢青蒿素作用组和顺铂对照组IC50值分别为1.30μg/ml和5.58μg/ml,两组比较差异显著(P<0.01),逆转倍数4.29。对A549/CDDP细胞,双氢青蒿素作用组和对照组凋亡率分别为17.6%和1.6%两组比较差异显著(P<0.01)。双氢青蒿素作用于A549/CDDP细胞后,Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升。结论:A549/CDDP细胞耐药作用与凋亡耐受有关,双氢青蒿素可使A549/CDDP细胞恢复对顺铂的敏感性,通过解除凋亡抑制从而逆转耐药。