干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。     

水通道蛋白3-siRNA和磷脂酶D2-siRNA对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨水通道蛋白(aquaporin,AQP)3-siRNA和磷脂酶D(phospholipase D,PLD)2-siRNA对黑素瘤(malignant melanoma,MM)细胞增殖和凋亡的影响。方法用脂质体转染法将siRNA导入人黑素瘤细胞株A375细胞。用CCK-8法检测细胞增殖。用细胞膜磷酯酰丝氨酸异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染AQP3-siRNA、转染PLD2-siRNA、同时转染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA后,A375细胞增殖均受到明显抑制(与正常培养组比较,P均0.01)。同时转染组与单独转染组(AQP3-siRNA组和PLD2-siRNA组)比较,细胞增殖差异有统计学意义(P均0.01)。转染AQP3-siRNA、同时转染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA后,A375细胞凋亡明显增加(与正常培养组比较,P均0.05)。同时转染组与单独转染组(AQP3-siRNA组和PLD2-siRNA组)比较,细胞凋亡差异有统计学意义(P0.05;P0.01)。结论 AQP3和PLD2与MM增殖和凋亡相关,AQP3/PLD2信号分子在MM的发生中具有协同作用。     

腺病毒介导p27mt基因转移诱导恶性黑素瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨突变型p27基因(p27mutant type gene;p27mt)对恶性黑素瘤A375细胞凋亡的调节作用。方法:利用重组腺病毒Ad-p27mt转染培养的人恶性黑素瘤A375细胞,用3H-TdR掺入法检测细胞增殖;流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法检测细胞凋亡。结果:重组腺病毒Ad-p27mt在MOI≥50时,可达到100%的转导效率。Ad-p27mt转染恶性黑素瘤细胞A375后,3H-TdR掺入法检测发现细胞增殖抑制;流式细胞术检测在G1期前出现亚二倍体凋亡峰;细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯带。TUNEL法检测凋亡指数分别为48.5±3.6(Ad-p27mt组)及4.2±0.8(空白对照组),差异有显著性(P<0.01)。结论:重组腺病毒介导的p27mt基因转移可诱导恶性黑素瘤A375细胞在Gl期阻滞并导致细胞凋亡。     

麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

目的探讨麦冬皂苷B对人黑色素瘤(Melanoma)A375细胞增殖,凋亡和细胞周期的影响以及相关机制。方法麦冬皂苷B处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;免疫印迹法检测麦冬皂苷B对A375细胞PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3表达的影响。结果麦冬皂苷B能抑制A375细胞增殖活力及PI3K/Akt/mTOR通路的活化;麦冬皂苷B促进了A375细胞内Bax和Cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡;麦冬皂苷B阻滞了A375细胞细胞周期,G0/G1期细胞比例明显升高;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了麦冬皂苷B的上述作用。结论麦冬皂苷B能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。     

miR-21、miR-494对黑素瘤A375细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响.方法 取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞,实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA.继而用Cy5标记的miRNA模拟物阴性对照转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率.用流式细胞仪检测转染后细胞增殖的变化.结果 从A375细胞中成功提出miRNA.定量PCR结果显示,当转染物miR-21抑制物浓度为120 nmol/L时,转染细胞内有miR-21模拟物最大程度的下调表达,2-△△Ct值为0.80(0.65 ～ 0.92),低于对照组;当miR-494模拟物浓度为250 nmol/L时,转染细胞内有miR-494模拟物最大程度的上调,2-△△Ct值为126.82(111.52～144.22),明显高于对照组;miR-21抑制物转染组与miR-494模拟物转染组G1期细胞比率分别为(61.61±3.25)％、(61.05±3.17)％,高于对照组(P＜0.05);增殖指数分别为(38.39±3.25)％、(38.95±3.17)％,低于对照组(P＜0.05);细胞凋亡率分别为(27.74±1.39)％、(34.30±2.35)％,高于对照组(P＜0.01),细胞转染效率达90％以上.结论 miR-21抑制物和miR-494模拟物促使肿瘤细胞的G1期阻滞和促进凋亡作用,miR-21可增强A375细胞增殖,有原癌基因样功能;miR-494可抑制A375细胞增殖,有抑癌基因样作用.     

芍药苷对人黑素瘤细胞株A375增殖凋亡的影响

目的:研究不同浓度芍药苷(PF)对人黑素瘤细胞A375增殖抑制及早期凋亡的影响.方法:将体外培养的人黑素瘤细胞株A375分为6组,5个实验组分别加入不同浓度PF(2、1、0.5、0.1、0.01 mg/mL),对照组不加PF.光镜下观察细胞密度及形态、MTT法测定细胞增殖抑制率,Amnexin V/PI染色法检测细胞早期凋亡率.结果:镜下观察可见随着PF浓度的增加,黑素瘤细胞株A375数量降低,贴壁能力渐差,细胞形态渐圆钝,甚至出现皱缩.与对照组相比,不同浓度PF处理A375细胞24h、48h和72 h后,PF对细胞有浓度依赖性的增殖抑制作用(P＜0.05),但未见明显的时间依赖性(P＞0.05).不同浓度PF干预24h时A375细胞的早期凋亡率,对照组和各实验组差异无统计学意义(P＜0.05).结论:PF能抑制人黑素瘤细胞株A375的增殖,这种抑制作用呈浓度依赖性而非时间依赖性,但对A375细胞早期凋亡率无明显影响.     

下调microRNA-192基因表达对恶性黑素瘤A375细胞增殖及早期凋亡的影响

目的:研究microRNA-192基因表达降低与恶性黑素瘤A375细胞增殖及凋亡的关系。方法:除空白对照组外,运用脂质体介导法将空载体和为microRNA-192设计的small interfering RNA(si RNA)转染到恶性黑素瘤A375细胞中,并利用实时定量PCR检测microRNA-192的表达。通过形态学观察、细胞计数法、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法以及流式细胞免疫学等方法,分析空白对照组、空载体对照组(lipofectamine2000)和实验组恶性黑素瘤A375细胞的增殖和早期凋亡情况。结果:空白对照组和空载体对照组之间相比较,细胞增殖和凋亡情况几乎一致,差异无统计学意义。与空载体对照组相比,实验组存活的恶性黑素瘤A375细胞的活性和数量明显降低,此现象并随着si RNA浓度的提高而愈发明显。另外,实验组恶性黑素瘤A375细胞细胞凋亡指数较空载体对照组明显升高。结论:通过下调恶性黑素瘤细胞中microRNA-192基因表达可能会有效地抑制恶性黑素瘤的生长并促使其细胞凋亡。     

血管内皮生长因子过度表达促进恶性黑素瘤细胞增殖机制研究

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)过度表达促进恶性黑素瘤(MM)细胞增殖的机制。方法:通过电穿孔法将VEGF165cDNA转染至MM细胞系A375中,细胞计数法、MTT法和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测A375细胞体外增殖效应和其分泌的VEGF蛋白水平,化学比色法和蛋白印迹法(Western Blot)分别检测转染前后的A375细胞合成的诱导型、内皮型、神经型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的活性和蛋白表达。结果:转染VEGF165cDNA后,A375细胞明显增殖,其分泌的VEGF在转染后72 h、96 h明显增加(P<0.01),其合成的iNOS的活性和蛋白表达在转染后48 h、72 h、96 h明显升高(P≤0.05),但在转染前后未检测到eNOS和nNOS的活性及蛋白表达,一氧化氮合酶抑制剂L-NAME呈剂量依赖性地抑制转染72 h后的A375细胞增殖活性。结论:iNOS可能在VEGF过度表达促进MM细胞增殖中发挥重要作用。     

白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察白花蛇舌草总黄酮（FOD）对体外培养黑色素瘤A375和B16细胞增殖和凋亡的影响。方法：体外培养黑色素瘤A375和B16细胞,使用不同浓度的FOD作用24 h、48 h,采用MTT比色法检测细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定细胞凋亡的影响。结果：FOD抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用呈明显的浓度和时间依赖性。结论：FOD能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

芳姜黄酮衍生物对A375人黑素瘤细胞增殖及凋亡作用的机制研究

目的：研究一种芳姜黄酮衍生物（ATD）对人皮肤黑色素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度（5、10、20、40、80μmol/L）ATD、长春新碱及芳姜黄酮体外作用A375及人皮肤成纤维细胞（HSF）48 h。CCK?8法检测细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果ATD、长春新碱及芳姜黄酮对A375细胞有抑制增殖作用,且呈剂量依赖性（ATD：R2=0.99,F=340.96;长春新碱：R2=0.99,F=349.19;芳姜黄酮：R2=0.89,F=25.41,均P<0.05）,三者IC50分别为（15.96±0.02）、（77.00±0.04）及（356.95±0.01）μmol/L。当药物浓度为5μmol/L及10μmol/L时,ATD对HSF增殖抑制率分别为（8±0.06）%和（25±0.02）%,长春新碱为（33±0.04）%和（29±0.08）%,芳姜黄酮为（49±0.09）%和（34±0.07）%;ATD对A375细胞抑制率分别为（26±0.06）%和（39±0.02）%,长春新碱为（8±0.04）%和（17±0.08）%,芳姜黄酮为（6±0.09）%和（10±0.07）%,与二甲基亚砜相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且ATD对A375细胞增殖抑制活性强于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）,但对HSF细胞毒性却明显低于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）。ATD、长春新碱及芳姜黄酮均可诱导A375细胞凋亡,caspase?3活性随3种药物浓度增加而增强,且药效为ATD>长春新碱>芳姜黄酮。流式细胞仪检测证实,3种药物都能诱导细胞发生不同程度凋亡,同芳姜黄酮及长春新碱相比,ATD能显著诱导细胞凋亡,且以晚期凋亡为主。随药物浓度增加,ATD组G1期A375细胞逐渐增多,G2期及S期细胞数明显减少。结论 ATD对A375细胞有抑制增殖及促凋亡作用,该作用明显强于芳姜黄酮及长春新碱,其机制可能是激活caspase?3,使细胞周期阻滞在G1期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。     

MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响

目的研究MEK/ERK通路阻断剂U0126对黑素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法噻唑蓝法(MTT)测定U0126和传统抗癌药物达卡巴嗪(DTIC)分别及联合作用时对黑素瘤细胞A375的增殖抑制作用;流式细胞术检测不同药物处理组的细胞周期及凋亡情况;Western blot检测U0126处理后细胞p-ERK1/2的表达。结果药物作用24h时U0126单一用药组对细胞的增殖抑制率高于DTIC单一用药组(P<0.01);联合应用U0126和DTIC对细胞的增殖抑制率明显高于DTIC用药组(P<0.01);U0126组与对照组相比,G1期细胞比例数提高了21.83%(P<0.01),凋亡率提高了13.96%(P<0.01),联合用药组与对照组相比G1期比例增加了26.64%(P<0.01),凋亡率亦明显提高了25.20%(P<0.01);不同浓度U0126处理细胞后,细胞的p-ERK1/2均明显降低(P<0.01)。结论 MEK/ERK通路阻断剂U0126可显著抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能与降低p-ERK1/2的表达从而参与细胞周期调控有关;联合U0126用药有望成为治疗黑素瘤新的有效途径。     

整合素β8在恶性黑素瘤细胞增殖及侵袭中的作用

目的:明确整合素β8(ITGB8)在恶性黑素瘤侵袭转移中的作用。方法:Transwell侵袭实验在黑素瘤细胞系A375中获得侵袭性癌细胞和相对静止性癌细胞,RT-PCR比较两者整合素家族的表达。流式分选ITGB8细胞,比较其侵袭能力的差异。使用siRNA敲除技术敲低ITGB8,敲低效率分别为:si1组50%,si2组70%,si3组80%,比较其增殖、侵袭能力的变化。Western bolt检测细胞周期蛋白、基质金属蛋白酶及EMT相关分子的表达变化,提取细胞核蛋白比较细胞核内β-catenin的变化。利用TCF4的启动子报告质粒检测Wnt/β-catenin信号通路的激活情况。结果:ITGB8在侵袭性癌细胞中高表达,是静止性癌细胞的5倍(P0.01);ITGB8阳性组侵袭细胞数为516±45,阴性组为120±22,差异有显著性(P0.01);与Mock组细胞相比,si2和si3组细胞的增殖速度明显减弱(P0.01),敲低后细胞阻滞在S期。与Mock细胞相比Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在si2和si3细胞中的表达明显减少,Ecadherin明显增加。si2、si3细胞核内β-catenin相比Mock组明显减少(P0.05)。敲低ITBG8后TCF4的启动子活性明显降低。结论:ITGB8对恶性黑素瘤的增殖及侵袭转移具有重要作用,可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。     

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。     

外周血单一核细胞凋亡对复发性生殖器疱疹患者Th1/Th2分化的影响

目的:研究复发性生殖器疱疹(RGH)患者外周血单一核细胞凋亡对Th1/Th2型细胞分化的影响。方法:分离RGH患者和健康体检正常人的外周血单一核细胞(PBMC),在PHA的刺激下体外培养48h后收集细胞和上清液,经流式细胞仪检测凋亡细胞,应用酶联免疫吸附试验检测培养上清液IL-2及IL-10。结果:RGH组新鲜血PBMC的凋亡率很低,与对照组相似(P>0.05)。培养48h后RGH患者的外周血单一核细胞凋亡明显高于正常对照组(P<0.001),RGH患者的培养上清液IL-2浓度明显低于对照组(P<0.001),而IL-10浓度显著高于对照组(P<0.001)。结论:PBMC凋亡异常严重影响了Th1/Th2型细胞分化,可能是导致复发性生殖器疱疹患者细胞免疫功能低下的重要机制之一,也可能在生殖器疱疹复发中起一定的作用。