人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

HBVe抗原的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有HBV e抗原基因的pcDNA3真核表达载体,并在BEL7402肝癌细胞中表达与鉴定.方法 设计合成针对e基因片段的PCR引物序列,以pUC19/3HBV为模板扩增出HBeAg基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点中,构建pcDNA-HBeAg真核表达载体.然后采用脂质体转染法将其转染人肝癌细胞系BEL7402肝癌细胞,分别运用逆转录PCR和ELISA在RNA水平和蛋白水平检测其在真核细胞中的表达.结果 所克隆HBV e抗原基因片段经测序完全正确;重组质粒转染BEL7402细胞后,检测有HBeAg表达.结论 成功构建pcDNA3-HBeAg真核表达载体,并在肝癌细胞中有效表达,为进一步体外研究HBeAg奠定基础.     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响

目的NOR1基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）的构建并了解其对肝癌细胞系HepG2生长的影响。方法将NOR；cDNA亚克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达载体上，并把重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR，经脂质体转染至HepG2细胞中，运用MTT法、台盼蓝排斥等试验、流式细胞仪等分析NOR，基因对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响。结果成功构建了NOR。基因真核表达体pcDNA3．1（＋）／NORl，经pcDNA3．1（＋）／NOR1转染后的HepG2细胞生长速度明显抑制（P〈0．05），且细胞从G0／G1期进入S期明显延缓。结论重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR1能在HepG2细胞内表达，且能影响HepG2细胞的生长。     

小鼠 miR-214真核表达载体的构建及其鉴定

目的：构建小鼠 miR-214的 pcDNA3．1（＋/-）真核表达载体并在 COS -7细胞中转染检测其表达。方法小鼠基因组 DNA 扩增得到 miR -214序列,将酶切后的 miR -214克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋/-）,重组 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214经过酶切和测序鉴定后转染 COS-7细胞并应用萤光定量 PCR 法检测 miR-214表达水平。结果小鼠 miR-214真核表达载体序列分析完全正确;转染 COS-7细胞后miR-214的表达水平可增加1．41倍。结论成功构建了 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214真核表达载体并能在真核细胞中进行表达,为进一步进行 miR-214的功能研究提供了实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定。方法用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+)载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+)-HBx。以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。结果 pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+)-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件。     

人EGFL7基因真核表达载体构建及鉴定

【目的】构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因的真核表达载体。【方法】通过聚合酶链式反应（PCR）方法扩增EGFL7目的片段,利用基因重组技术构建pEGFPC1-EGFL7真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,通过Westernblot方法检测目的蛋白的表达。【结果】通过酶切和测序鉴定,pEGFBC1-EGFL7真核表达载体序列正确,编码框正确。转染后的293T细胞经Westernblot检测,能够表达目的蛋白。【结论】本方法成功构建了EGFL7真核过表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建与临床应用

目的构建经血管内皮生长因子165(VEGF165)转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,并对其在促进深度烧伤患者创面愈合过程中的作用进行评价。方法将30例深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者随机分为2组,每组15例。移植转染有VEGF165成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物组为实验组,单纯脱细胞异种真皮替代物移植组为对照组。采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的人成纤维细胞,再将转染后的人成纤维细胞接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于深度烧伤患者切痂后创面,对创面愈合情况进行观察并与单纯脱细胞真皮移植组进行比较。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165可成功转染人成纤维细胞,经转染的人成纤维细胞可顺利接种于脱细胞真皮形成成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,替代物移植后实验组患者皮片成活率(90.25±5.39)%,对照组患者皮片成活率(83.98±3.63)%,两者有显著性差异(t=3.737,P<0.01)。实验组新生的毛细血管数量要明显多于对照组。结论经VEGF165转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物具有显著的促进深度烧伤患者创面愈合的作用。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E表达载体的构建

目的 构建水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E的真核表达载体。方法用PCR方法扩增VZV糖蛋白E基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1并用双酶切和测序方法鉴定。结果扩增的目的基因包括了全长的糖蛋白E基因，长度约1．9kb。并且成功构建了糖蛋白E基因重组表达载体。结论构建的重组表达载体基因序列正确，为进一步研究此蛋白的免疫原性打下了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

构建人 COX-2反义核酸真核表达载体对膀胱癌 T24细胞株COX-2表达的作用

【目的】构建人环氧化酶-2（COX-2）反义核酸真核表达载体,探讨其抑制膀胱癌 T24细胞COX-2表达的作用。【方法】经PCR法从含人COX-2基因的质粒中扩增其cDNA ,通过限制性内切酶克隆于 T载体EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ位点之间,并将其反向插入pcDNA3．1中获得重组质粒。应用脂质体介导将其导入T24膀胱癌细胞中,经过G418筛后进行流式细胞术、间接免疫荧光染色和RT-PCR鉴定。【结果】核酸测序和限制性内切酶消化证实重组COX-2反义核酸真核表达质粒 pcDNA3．1/COX-2 as是正确的,经鉴定转导 pcD-NA3/COX-2 as的T24细胞中环氧化酶-2的表达明显抑制。【结论】成功构建人COX-2反义核酸真核表达载体并获得环氧化酶-2基因表达持续下调的膀胱癌细胞株T24-AS。