金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因（SEA）进行克隆、鉴定与表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法 用聚合酶链反应（PCR）扩增SEA基因，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上，经测序反应确定无误，酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b（＋）构建表达SEA的重组质粒。将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经双酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌B121菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。结果 构建了表达载体pET42b（＋）-SEA，并获得高效表达，表达的蛋白质相对分子质量为27000，重组蛋白（rSEA）在37℃、25％经异丙基硫化-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导时均以包涵体形式存在。结论 SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达，为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞内钙离子浓度动态变化及其信号传导途径的研究

目的：探讨葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）内钙离子（Ca^2＋）浓度的动态变化及其信号转导途径。方法：在葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入不同浓度的蛋白激酶C抑制剂（Hypericin）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Apopain）、蛋白酪氨酸激酶抑制剂（Genistein）、一氧化氮合酶抑制剂（NAME）,利用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察HK-2细胞内[Ca^2＋]动态变化。结果：LSCM下观察发现,150mmol/L葡萄糖可引起HK-2细胞内[Ca^2＋]增高。150mmol/L葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入10^-4mmol/LHypericin、10^-6mmol/LApopain、10^-7mmol/LGenistein、10^-2mmol/LNAME可抑制葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca^2＋]增高。结论：葡萄糖作用于HK-2细胞,可引起细胞内[Ca^2＋]增高;蛋白激酶C、caspase-3、蛋白酪氨酸激酶、一氧化氮（NO）均参与了葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca^2＋]增高的信号传导过程。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

人胃腺癌细胞发生未折叠蛋白质反应时相关基因和蛋白质表达的研究

目的:探讨胃癌AGS细胞在无营养培养条件下发生内质网应激时的未折叠蛋白质反应(UPR)相关基因和蛋白质的表达。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白印迹,检测胃癌AGS细胞在无营养条件培养下发生UPR时相关基因和蛋白质的表达。结果:实时荧光聚合酶链反应检测胃癌AGS细胞在无营养条件下培养1h、3h、24h、48h的情况,发现其中ATF4、CHOP的mRNA表达均明显高于正常培养的胃癌AGS细胞(对照)(P<0.05):而培养1h、3h、24h时的ATF6、Bip、PERK的mRNA表达量明显高于对照(P     

脂联素基因-3971A/G多态性与脑梗死关系的研究

目的探讨脑梗死患者(CI)与脂联素基因-3971A/G多态性的关系。方法运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对126名对照者和150例CI患者的脂联素基因启动子3971多态性进行检测。结果对照组和CI组的基因型频率分别为67.20%、26.40%、6.40%;82.00%、16.67%、1.33%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P0.05)。两组的等位基因频率分别为80.40%、19.60%;90.33%、9.67%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P0.05)。CI组的脂联素基因-3971位各型的TG、血糖、收缩压均明显高于对照组(P0.05),而TC、HDL-Cn、onHDL-C、LDL-C、舒张压在两组间无统计学意义(P0.05)。经过多元逐步Logistic回归分析显示TG的OR值为1.414,95%CI(1.059-1.888);血糖的OR值为1.034,95%CI(1.018-1.051);收缩压的OR值为1.339,95%CI(1.098-1.633);GG型的OR值为2.289,95%CI(1.243-4.215)。结论脂联素基因-3971A/G多态性的GG型可能是CI发病的一个独立危险因子。     

对氧磷酶基因多态性与脑梗死关联性的探讨

目的:探讨我国上海地区汉族人群的对氧磷酶1(PON1)基因T-107C、PON2 Ser311Cys基因多态性与脑梗死发病乃至颈动脉硬化之间的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,检测134例脑梗死患者和103名健康对照者PON1 T-107C、PON2 Ser311Cys的多态性基因型,并研究其对脑梗死发病的影响。结果:多因素多元逐步Logistic回归分析显示,三酰甘油、总胆固醇是脑梗死的独立危险因素;同时,脑梗死组的PON1 T-107C、PON2 Ser311Cys基因型及等位基因频率分布与健康对照组间差异均有统计学意义(P     

混合型高脂血症与肝脂酶基因启动子250G/A多态性的关系

目的:探讨混合型高脂血症与肝脂酶基因启动子250G/A多态性的关系。方法:运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术,检测195名对照者和105例混合型高脂血症患者的肝脂酶(HL)基因启动子250G/A多态性,并研究其对血脂水平的影响。结果:混合型高脂血症组HL基因型和等位基因频率分布与对照组相比,均有显著差异(P＜0．05);GAvs GG,0R=1．446,95%CI:0．829～2．524;AA vs GG,OR=4．076,95% CI:2．068～8．035;A vs G, OR=1．978,95%CI:1．408～2．777。在混合型高脂血症组中除患者年龄和AA型载脂蛋白Al(Apo Al)水平外,其他基因型的各项指标均与对照组相同基因型有显著差异(P＜0．05)。混合型高脂血症组各基因型间的血脂指标均无差异(P＞0．05);而对照组AA型的TG水平明显高于GG型、GA型(P＜0．05),LDL-C水平则明显高于GG型(P＜0．05)。结论:HL基因启动子250G/A多态性与混合型高脂血症的发生相关,并可影响血浆脂类代谢。     

两种结核分枝杆菌分泌抗原的基因克隆及表达鉴定

对结核病的诊断目前主要依据细菌学检查与PPD,而以抗原抗体为基础的便捷的血清学方法目前尚不成熟.常用的以PPD为抗原的ELISA检测法不够简便、快速,灵敏性和特异性也较差,且卡介苗(BCG)接种后,可使个体PPD反应呈阳性,从而削弱其诊断结核分枝杆菌感染的价值.     

炎症性肠病Toll样受体的基因多态性及其在不同人群中的分布

目的 了解上海地区汉族炎症性肠病(IBD)患者TLR4(Asp299Gly、Thr399Ile)和TLR2的基因(Arg677Trp、Arg753Gln)多态性,探讨其多态性与IBD的相关性,并与其他国家不同人群中该基因多态性分布进行比较.方法 采用PCR-RFLP法,对IBD组(n=84)和健康对照组(n=135)进行TLR4(Asp299Gly、Thr399Ile)和TLR2的基因(Arg677Trp、Arg753Gln)多态性检测,PCR产物进行核苷酸序列分析.结果 在IBD组和对照组中均未发现TLR4突变基因(Asp299Gly、Thr399Ile)和TLR2突变基因(Arg677Trp、Arg753Gln).结论 TLR4基因(Asp299Gly、Thr399Ile)和TLR2基因(Arg677Trp、Arg753Gln)多态性与上海地区汉族人群IBD易感性无明显相关性;在其他国家不同人群中分布的多态性可能是由种族差异所造成的.     

表达淋病奈瑟菌隐蔽性质粒cppB重组体的构建及鉴定

淋病奈瑟菌的ｃｐｐＢ基因 (ｃｒｙｐｔｉｃｐｌａｓｍｉｄＢ)通常位于隐蔽性质粒上 ,其功能不清 ,96 %的淋病奈瑟菌含有此质粒 ,其它奈瑟菌不含此质粒。ｃｐｐＢ基因可表达一段 2 3ｋｕ的蛋白质 ,对其蛋白质的功能研究 ,一方面可寻找一种特异的诊断试剂 ,另一方面也为淋病奈瑟菌致病的复杂机理研究提供依据。本文用基因工程技术对淋病奈瑟菌ｃｐｐＢ基因进行克隆 ,为进一步研究蛋白质功能提供基础。1　材料与方法1 1　质粒、菌株、酶及所用试剂　ｐＥＴ42ｂ(+)质粒 :ＤＨ5α菌株 ;ｐｆｕＤＮＡ聚合酶、ＮｄｅＩ内切酶、ＸｈｏＩ内切酶、Ｔ4…