我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点

目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。     

单启动子双表达载体pIRES-p16ink4a-hRb1的构建及其抑制骨肉瘤细胞增殖的初步分析

应用内部核糖体插入位点（IRES）序列构建单启动子双表达穿梭载体质粒pIRES-pI6ink4a-hRb1,导入骨肉瘤MG-63细胞株后,在基凶和蛋白水平鉴定表达,并观察细胞增殖情况,探讨研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用。     

双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的构建与鉴定

目的:为适应恶性肿瘤免疫治疗中多基因联合应用的需要,在真核表达载体pVAX1的基础上,利用内部核糖体进入位点IRES序列,构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES,以增强DNA疫苗的免疫疗效.方法:通过PCR扩增获得目的基因IRES并定向克隆到pVAX1载体中,然后在IRES序列的上下游分别插入红色荧光蛋白基因DsRed1和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,瞬时转染人胚胎肾细胞293T,通过流式细胞术和免疫荧光验证基因表达.结果:pVAX1-IRES经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致,DsRed1基因和EGFP基因在pVAX1-IRES载体中,不仅可以分别表达,而且可以同时表达,显示该双顺反子真核表达载体构建成功.结论:pVAX1-IRES双顺反子表达载体的构建,为基因联合表达和恶性肿瘤的免疫治疗作了必要准备.     

DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较

目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。     

癌基因rasP~(21)、c-myc和P~(53)在乳腺增生与乳腺癌中的表达相关性及其生物学意义

目的:探讨癌基因在乳腺增生、乳腺癌中的表达相关性和生物学意义.方法:应用S-P微波免疫组化法检测乳腺单纯性增生、不典型增生(各20例),乳腺癌(40例)中rasP~(21)、c-myc、P~(53)基因产物的表达.结果:rasP~(21)在不典型增生和癌中阳性表达率较高(60%及47.5%),C-myc和P~(53)在乳腺癌及伴有转移的癌中表达率最高(57.5%—52.5%和73.3%—73.3%),良性病变表达率极低.结论:P~(21)基因在细胞早期癌变过程中具有引发作用,可能为癌的启动基因,而c-myc、P~(53)的激活与突变和乳腺癌的发生发展及癌瘤分化,侵袭转移的生物学行为和预后密切相关.     

HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的意义

目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义.方法 对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析.对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究.构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响.结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3％(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9％(9/314)(P＜0.01).HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9％(15/32)和22.6％(57/252) (P＜0.01).从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s 131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0％、2.0％和2.5％,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6％,但无sP120缺失+G145D联合突变.与野生株相比,新型突变株复制力提高31％,但HBsAg定量降低99％.免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响.结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性.     

用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体

目的 :构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体。方法 :将微小RNA病毒内部核糖体进入位点 (IRES) ,亚克隆到质粒载体 pCdhfr1多克隆位点 ,构建了哺乳动物细胞双表达载体 pCdhfr5。 结果 :pCdhfr5具有两处多克隆位点 ,由IRES相连。能同时表达两个外源基因。把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到 pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒 pFN ,经脂质体法转染CHO细胞 ,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株。结论 :双表达载体的构建成功为进一步研究表达抗体全分子的CHO细胞株奠定了基础     

登革4型病毒5''非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立

目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.     

中国人睑裂狭小综合征Ⅰ型患者大家系FOXL2基因突变检测

目的 研究分析中国人睑裂狭小综合征(BPES)Ⅰ型患者的一个大家系共4代19例的FOXl2基因突变,以明确突变位点及突变类型,确定临床表型与基因型之间的对应关系.方法 采集一个中国人BPES Ⅰ型大家系19例样本外周静脉血EDTA抗凝血样5ml,提取基因组DNA,共设计7对引物,应用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术对FOXL2基因的外显子和启动子区进行突变筛查.结果 该家系中8例患者均检测到FOXL2基因突变,为1002C>G无义突变,11例家系健康人中均无此突变.结论 首次在中国人BPES Ⅰ型大家系患者中发现FOXL2基因1002C>G无义突变,提示该突变可能是BPES综合征I型的致病机制之一.     

血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。     

东部马脑炎病毒E2基因与GM-CSF共表达质粒的构建及其免疫原性初步研究

目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果.方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒.Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性.通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4 /CD8 淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性.结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确.转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录.Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50 000位置有特异性条带.将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光.免疫小鼠的最高血清抗体效价为1:160,但细胞免疫未观察到明显的提高.结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价.     

miRNA在肝癌中的价值

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,具有高度侵袭性和复发率,大部分肝癌患者就诊时已经进入中晚期,错失了最佳治疗时机,且预后较差,因此寻找早期肝癌诊断和预后判断的生物分子标志物是十分必要的.Micro RNA(miRNA)是一类内源性、长度为20~25个核苷酸的非编码小RNA,在血清或血浆中表现出高度的稳定性.大量研究表明miRNA在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用,并能同时调节多个靶基因,参与肿瘤的发生发展.因此,肝癌患者和正常人血清样本中表现出显著差异的miRNA可能对肝癌患者的诊断和预后有着潜在的指示作用.     

基因回路调控元件的研究进展

启动子、终止子、核糖开关及核糖体作用相关序列等分别在转录、翻译以及翻译后修饰等不同水平参与基因表达调控,实现目的 基因的精确表达.它们作为基因调控元件广泛用于基因回路的构建,在基因组工程和代谢工程中发挥了重要作用.该文简要概括了基因回路中这些常见调控元件的结构特征、作用机制及其改构方式,阐述了天然及人造基因调控元件在代谢途径优化中的作用,并对未来基因回路的构建及应用进行了展望.     

新疆苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因第11、12外显子点突变分析

目的 分析新疆地区苯丙酮尿症(PKU)患者中苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因第11、12外显子点突变.方法 应用PCR及单链构象多态性(SSCP)分析技术结合基因序列测定方法进行筛查和鉴定.结果 在37例PKU患者共74条染色体中,检出基因突变5种,其中第11外显子2种,即无义突变Y356X和剪接位点突变V399V,突变发生率分别为5.4%和5.4%,外显子11的等位基因频率是10.8%;第12外显子3种,全部为错义突变,分别是R413P、R408W及A434D,其突变发生率为4.1%、1.4%和1.4%,外显子12的等位基因频率占6.8%.上述突变中,R413P以日本人最为常见,Y356X和V399V多集中于我国北方地区,而R408W则是欧美及拉美等国最多见的基因突变.结论 新疆地区是中国与亚欧地区之间一个较为特殊的PAH突变基因分布带,具有明显的地域特征.     

胃癌组织中p16、c-myc和cox-2基因表达及其与预后的关系

 目的 探讨胃癌组织中p16,c-myc和cox-2表达情况、相互影响及其与预后的关系.方法 应用免疫组化SABC法检测104例手术切除胃癌组织中p16,c-myc和cox-2的表达.结果 胃癌中p16,c-myc和cox-2表达阳性率分别为39.4%(41/104)、57.7%(60/104)、63.5%(66/104).p16表达与浸润深度,淋巴结有无转移,TNM分期,组织学类型有关(P<0.05);c-myc表达与浸润深度,淋巴结有无转移,TNM分期有关(P<0.05),而与不同组织学类型无相关性(P>0.05);cox-2表达与淋巴结有无转移,TNM分期,组织学类型有关(P<0.05),而与不同的浸润深度无关(P>0.05).等级相关分析结果显示,p16与c-myc和cox-2表达呈负相关(P<0.05),c-myc与cox-2表达呈正相关(P<0.05).生存曲线研究显示p16,c-myc和cox-2表达与患者术后生存时间显著相关(P<0.05).结论 p16在胃癌组织中低表达及c-myc和cox-2高表达能客观反映胃癌组织分化程度和侵袭转移能力,且与预后密切相关.因此,检测三种指标可有助于判断胃癌预后,指导治疗.     

登革4型病毒基因组cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用

目的:探讨登革4型病毒C基因中保守的cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用.方法:首先在获得含有海肾荧光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建cHP发卡结构系列突变体(cHP1～cHP6).将构建的突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因检测技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译进行检测.结果:cHP发卡结构系列突变体均可在BHK-21细胞中复制并稳定表达病毒特异蛋白,在该发卡结构中引入缺失或突变对病毒早期翻译并无显著影响,但病毒RNA复制均显著下调.结论:cHP发卡结构在基因组RNA复制过程中可能具有重要的调控作用.     

慢性HBV感染患者恩替卡韦基因型耐药突变特征分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者反转录酶(RT)区恩替卡韦(ETV)基因型耐药突变特征及其临床意义。方法提取3800例慢性HBV感染患者血清中的HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVRT基因,PCR产物直接测序检测RT突变,分析与ETV耐药相关突变的形式及其临床意义。结果 3800例慢性HBV感染患者中,128例(3.4%)检出38种ETV基因型耐药突变,以rtT184位点替换突变最常见(79/128,61.7%),包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变。共有5种替代突变形式rtT184L/I/A/S/F,其中rtT184L(29/30)、rtT184A(7/7)和rtT184S(10/12)均伴随rtL180M+rtM204V突变,而rtT184I多伴随rtM204I突变(7/8)。rtS202位点突变33例(25.8%),全部为rtS202G,包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变,多伴随rtL180M+rtM204V突变。rtM250位点突变23例(18.0%),其中rtM250L(15/17)常伴随rtM204I突变,而rtM250V均伴随rtL180M+rtM204V突变(5/5)。仅6例(4.7%)检出rtI169T突变并均伴有rtT184位点的突变。还检出同时含有ETV及阿德福韦(ADV)耐药位点的多药耐药突变3例。ETV耐药突变多出现在拉米夫定(LAM)和ETV经治的患者(96/128,75.0%),其中以LAM→ADV→ETV(42例)和LAM→ETV(28例)为主;还出现在LAM经治而未用过ETV治疗的患者(27/128,21.1%),其中以LAM单一治疗(10例)和LAM→ADV(9例)为主。结论慢性HBV感染患者抗病毒治疗中出现的ETV耐药突变多见于单药序贯治疗,突变形式以rtL180M+rtM204V+rtT184L或rtS202G为主,而rtI169T突变在ETV耐药中不起重要作用。     

新疆部分地区三种重要牛羊虫媒病毒病流行情况调查

本研究采用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法,对新疆四个地区(哈密地区、昌吉地区、伊犁地区和和田地区)的106份牛、羊血样分别进行了蓝舌病(BT)、牛流行热(BEF)和鹿流行性出血热(EHD)的抗体检测。结果显示蓝舌病(BT)抗体仅在哈密地区血样中检出,其中牛检出率为12.90%,羊检出率为60%;牛流行热(BEF)抗体在哈密、伊犁和和田地区的牛血清样本中检出率均为100%,昌吉地区检出率为55%;鹿流行性出血热(EHD)抗体仅在哈密地区羊血清样本中检出,检出率为20%。哈密地区的牛血清样本中同时检出BEFV和BTV两种病毒的为12.9%,羊血清样本中同时检出BTV和EHDV两种病毒的为20%;以上结果说明在新疆地区有蓝舌病、牛流行热和鹿流行性出血热的流行,并且存在多种虫媒病混合感染的情况,应在实际检测、防疫工作中加以注意。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.