体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的 体外培养人牙囊细胞,探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征,是否可作为牙骨质再生的种子细胞。方法 酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞,免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达,RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞,行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果 免疫组化结果:牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达;RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节,von Kossa染色阳性。结论 牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性,体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力,可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的体外培养人牙囊细胞，探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征，是否呵作为牙骨质再生的种子细胞。方法酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞，免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达．RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞，行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果免疫组化结果：牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达：RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节，von Kossa染色阳性。结论牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性，体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力，可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

兔脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究

目的探讨兔脂肪组织来源脂肪基质细胞的分离培养方法及其成骨活性．方法取成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织1～2mL,采用机械切割及Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织中分离获得脂肪基质细胞,原代培养及传代以后,以诱导培养基（内含10mmol／Lβ-甘油磷酸钠、10～8mol／L地塞米松、50mg／L维生素C）进行诱导培养．实验评估：应用形态学观察、碱性磷酸酶钙-钴法染色检测碱性磷酸酶,Von Kossa钙化结节染色检测钙化结节的形成等方法来鉴定诱导分化所得细胞的成骨活性．结果行诱导培养的脂肪基质细胞呈多层成长,形态多为梭形,细胞外基质有白色钙化结节形成;细胞增殖速度减慢,生长周期变长．碱性磷酸酶钙钻法染色及Von Kossa钙化结节染色后均表现为阳性,未诱导培养的脂肪基质细胞则表现为阴性．结论初步建立了一套南脂肪组织分离培养脂肪基质细胞的方法,并证明该细胞在体外诱导培养条件下具备向成骨细胞分化的能力．     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

人脂肪源性干细胞成骨诱导过程中I型胶原的表达

目的：研究人脂肪源性干细胞（hADSCs）成骨诱导后其合成和分泌Ⅰ型胶原能力的变化,探讨hADSCs作为组织工程骨的种子细胞的效能。方法：从人脂肪抽吸物中分离基质细胞,体外培养、扩增及鉴定。采用成脂诱导剂诱导hADSCs向脂肪细胞分化,采用油红O染色鉴定。采用成骨诱导剂诱导hADSCs向成骨细胞分化,将成骨诱导组分为0、7、14、21和28 d组,分别于0、7、14、21及28 d行茜素红染色检测矿化结节、Van Gieson胶原纤维特殊染色染胶原纤维、Ⅰ型胶原细胞免疫荧光染色检测细胞Ⅰ型胶原的表达。用FV Viewer 1.7软件对Ⅰ型胶原表达的强度进行定量检测。结果：hADSCs成脂诱导14 d后油红O染色阳性;hADSCs成骨诱导21 d茜素红染色阳性;成骨诱导21 d Van Gieson胶原纤维特殊染色阳性;hADSCs成骨诱导后Ⅰ型胶原染色21 d所有的细胞均阳性表达,28 d呈强阳性表达。统计结果显示：Ⅰ型胶原的表达从7 d开始,到28 d逐渐升高,7、14、21和28 d组与0 d组比较差异均有显著性（P<0.05）。结论：hADSCs成骨诱导后全部细胞呈现成骨表型,成骨能力强,可以作为骨种子细胞应用于临床骨再生治疗。     

兔骨髓基质细胞培养及其体外成骨能力

目的观察兔骨髓基质细胞在体外的培养条件及其成骨过程，为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定一定实验基础。方法取兔长管骨骨髓为材料进行体外培养，传代后改用条件培养基进行培养，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行检测。结果传代细胞培养3、4d后融合成单层，培养12d细胞形成多层结构，并聚集成多个散在的黑色结节，细胞富含碱性磷酸酶活性，Ⅰ型胶原染色阳性，这与典型成骨细胞的生物学特性相似。结论体外培养的兔骨髓基质细胞具有成骨能力，可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化

目的探讨体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的方法,以及钙结节形成、Ⅰ型胶原表达等情况. 方法分离人骨髓间充质干细胞,经过原代培养和传代培养,分别加入成骨诱导、脂肪诱导培养体系,经过倒置显微镜观测与HE染色了解诱导后细胞形态变化,并通过von Kossa染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、苏丹黑染色与油红O法染色鉴定细胞的性质.另取2代细胞体外培养,加入成骨诱导分化试剂,以碱性磷酸酶(ALP)为检测指标计数细胞阳性率,比较成骨诱导1、2、3、4周时细胞碱性磷酸酶的变化.结果体外培养的MSCs在合适的条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞分化.细胞经成骨诱导2～3周时细胞碱性磷酸酶阳性率最高,达到85%.结论 MSCs体外培养在一定条件下向成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞分化,体外培养时形成钙结节,并表达Ⅰ型胶原.培养2～3周后细胞经成骨诱导分化细胞ALP阳性率较高.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 