海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定

本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。     

重组人血管内皮抑素的阳离子交换色谱复性与纯化条件研究

对rhEndostatin包涵体蛋白的色谱复性条件进行研究,摸索出最佳的复性、纯化条件,解决其在大肠杆菌中表达提取时遇到的蛋白变性问题。按实验条件对表达的rhEndostatin包涵体蛋白进行提取、洗涤、变性;利用正交法设计重组蛋白的色谱复性、纯化实验;利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对rhEndostatin包涵体蛋白进行了色谱复性、纯化。最佳复性条件为rhEndostatin上样浓度为2.5 mg/mL,洗脱体积流量为1/20床体积/min(3.5 mL/min),NaCl浓度0.1 mol/L,GSH/GSSG的浓度比为3/0.3 mmol/L。在此条件下纯度约97%,蛋白回收率为90%,重组蛋白的活性最高,IC50达到5μg/mL。     

重组人胰岛素pET28a-IHI下游工艺研究

目的对含有重组人胰岛素原基因的大肠杆菌工程菌pET28a-I HI摇瓶发酵,并探讨采用磺酸化方法对包涵体蛋白纯化复性的工艺。方法工程菌pET28a-I HI经摇瓶发酵、机械破碎得到包涵体,包涵体经过磺酸化、等电点沉淀、DEAE-52柱层析三步纯化后采用15%SDS-PAGE电泳检测,经过复性,酶切,DEAE-52纯化后,冷冻干燥,样品进行HPLC检测以及整体生物学活性实验。结果工程菌表达量约在30%左右,经过三步纯化,包涵体纯度可达98%以上,酶切之后经质谱检测,与人胰岛素标准品相对分子质量一致,而且动物实验降血糖效果明显,1 L发酵液最终可得到人胰岛素140mg。结论该工艺耗时短,效果好,成本较低。     

从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65％。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90％,酶比活力为5400u／（mg蛋白）。     

从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).     

白细胞相关免疫球蛋白样受体-2的克隆、原核表达及纯化

以人白细胞相关免疫球蛋白样受体-2 (LAIR-2/CD306) cDNA质粒为模板,通过PCR技术获得该蛋白成熟区基因片段,插入表达载体pET28a的多克隆位点,进而将构建的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,所得重组蛋白以包涵体形式存在,包涵体经变性、复性及亲合色谱分离后获得重组蛋白.     

重组猪促肾上腺皮质激素在大肠埃希菌中的高效表达与分离纯化

本研究建立了一种以大肠埃希菌作为宿主,表达重组猪促肾上腺皮质激素(pig adrenocorticotropic hormone,pACTH)的新方法。pACTH在N末端与经典猪瘟病毒N末端自切蛋白酶Npro突变体EDDIE融合,然后在大肠埃希菌胞浆中以包涵体形式表达,包涵体约占菌体湿重的36.2%。经过复性后的包涵体可以促使EDDIE自酶切,从而获得pACTH。通过优化复性条件,EDDIE-pACTH蛋白的自切率从25%提高至60%。复性液通过酸沉淀,能够去除杂蛋白,经反相色谱纯化后获得纯度为99.56%的pACTH。     

重组羧肽酶原B在大肠杆菌中的可溶性表达及活性羧肽酶B的纯化

实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化,得到活性CPB.采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达;优化酶解激活条件,提高粗酶液比活.粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octyl-FF疏水柱两步纯化.结果：实现可溶性表达的最佳条件为15℃下,0.1 mmol/LIPTG诱导20 h.此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化,得到比活为128.2 u/mg protein的较纯的活性CPB,活性回收率达39%.     

重组人干扰素α-2b的梯度凝胶色谱柱复性和同步纯化

利用盐酸胍浓度梯度凝胶色谱柱复性法从大肠杆菌表达的重组人干扰素α-2b（rhIFNα-2b）包涵体的溶解液中复性rhIFNα-2b。通过考察线性盐酸胍梯度下盐酸胍终浓度、梯度长度、流速、复性液中还原型／氧化型谷胱甘肽比例等因素，探索了盐酸胍梯度凝胶色谱柱复性rhIFNα-2b的优化条件。结果表明，复性后rhIFNα-2b的蛋白收率是透析复性法的4．2倍，活性回收率为68．7％，比活力1.77×10^8IU／mg，纯度高于90％。     

非融合rIL-24蛋白的制备及活性鉴定

目的制备非融合的rIL-24蛋白,鉴定其体外诱导肿瘤细胞凋亡活性。方法为制备非融合IL-24蛋白,将IL-24基因插入到pET32a(+)上KpnⅠ与BamHⅠ之间,构建表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coliBL21(DE3)中表达。洗涤后的包涵体溶解在2 mol/L尿素(pH9.0)中,采用镍离子亲和色谱和凝胶分子筛的二步法纯化,肠激酶酶切(肠激酶与蛋白1∶400,pH7.5处理36 h),再用亲和柱色谱纯化制备非融合的rIL-24。MTT法和形态学观察分析rIL-24体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果重组工程菌以包涵体形式表达出相对分子质量约为35 000的融合蛋白。包涵体经洗涤、溶解及二步纯化得到纯度大于95%的Trx-IL-24。融合蛋白用肠激酶酶切之后,经亲和色谱制备得到纯度大于98%的非融合蛋白rIL-24。rIL-24显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05),而对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。结论IL-24基因在E.coli中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的非融合蛋白rIL-24,预示其具有肿瘤治疗应用的前景。     

人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达

目的构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cD-NA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达。方法取2型糖尿病人(BMI>28kg.m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Westernblot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化。结果测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式。IPTG诱导的最佳浓度是0.05mmol.L-1,时间为5h,温度为37℃。结论成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础。     

重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究

目的研究重组人干扰素α 2b包涵体的纯化方法。方法超声破碎菌体 ,干扰素α 2b包涵体经洗涤液洗涤后 ,SDS -PAGE检测其纯度 ,VSV -WISH细胞系统测定干扰素活性。结果差速离心很难完全将包涵体和细菌碎片分开。超声破碎 6次和 9次的干扰素α 2b包涵体纯度和活性相近 ,均明显高于 3次超声破碎处理的包涵体。用含2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液对干扰素α 2b包涵体洗涤 ,能提高包涵体纯度。结论建议超声破碎 6次 ,用含 2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液纯化干扰素α 2b包涵体     

正交试验优选尼古丁-β-环糊精包合物的制备工艺及质量考察

目的:优化尼古丁-β环糊精包合物的制备工艺,并评价其质量。方法:采用饱和水溶液法制备尼古丁β-环糊精包合物,利用正交试验法,选取尼古丁与β-环糊精的配比(A)、包合温度(B)、包合时间(C)为因素,以包合率和收率为指标优选包合物最佳制备工艺,采用包合平衡常数法验证包合物的形成并考察包合物体外溶出特性。分别对尼古丁β-环糊精包合物及其混合物进行高温、高湿和强光试验,考察其稳定性。结果:最佳包合条件A为1:3,B为60℃,C为2 h,包合率达65.28%,收率为79.55%。150 min缓慢释药量达92.26%。在不同温度、湿度和强光条件下,包合物中尼古丁的含量均显著高于混合物。结论:所选制备工艺简单且条件易于控制,所制包合物稳定性良好且具有缓释作用。     

GLP-2融合蛋白的初步纯化

目的 对包涵体的提取,洗涤等融合蛋白的获取条件进行研究,同时初步探索了融合蛋白的酸水解条件.方法 包涵体用TEMFX洗涤1次,0.5％ Triton洗涤4次,加入25％(v/v)的8mol/L尿素变性溶解包涵体沉淀,再进行乙醇分级沉淀.结果 所得融合蛋白纯度达到77.582％.按6％的比例加入60 mmol/L Hcl,50℃、4.8 h基本水解完全.结论 应用本文方法对GLP融合蛋白初步纯化简便可行,为进一步研究奠定必要的基础.     

β-环糊精包合青皮、木香挥发油的工艺研究

采用L_9（3~4）正交试验法，研究了β－环糊精包合青皮、木香混合挥发油的工艺。通过对挥发油利用率、包合物收得率及包合物含油率3个指标的考察，优选出包合工艺为A2B2C3，即β－环糊精：挥发油为6：1，包合温度为55℃，包合时间为3h。显微镜成像法和薄层层析法验证了包合物的形成。     

TEM-1型β-内酰胺酶基因的克隆、表达及酶的纯化

开发专一性β-内酰胺酶抑制剂,对解决细菌耐药性问题具有重要意义.这项研究需要用到纯度较高的β-内酰胺酶.我们将TEM-1型β-内酰胺酶基因克隆到一个高表达载体中,研究了该酶在大肠杆菌中的高表达条件及分离纯化方法,最终获得的酶纯度大于90%.     

腺苷-β-环糊精包合物的研制

目的研究腺苷-β-环糊精包合物的制备方法。方法对包合条件进行选择;考察包合物形态以及包合物在50g·L-1葡萄糖溶液中的体外释放行为。结果确定包合条件为,包合主∶客分子比为1∶2,包合时间为2h,温度为50℃,包合率达55%以上,包合物在50g·L-1葡萄糖溶液中4h释放为95%。结论腺苷-β-环糊精包合物可明显提高腺苷的稳定性,具有一定的缓释作用。     

抗癫痫肽/GST融合表达载体的构建及蛋白表达

目的构建抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide,AEP)/GST融合表达载体,原核表达GST-AEP融合蛋白。方法从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切,得到AEP片段;通过中间载体puc18,转换酶位点;最后将AEP基因克隆入表达载体pGEX-4T-1质粒中,构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP;转化感受态大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-AEP融合蛋白;SDS-PAGE分析表达产物,确定蛋白质高表达条件;超声裂解法鉴定蛋白质可容性;凝胶薄层扫描确定蛋白质相对表达量。结果经酶切鉴定、测序证明,AEP基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量约为36 000的融合蛋白,该融合蛋白以包涵体形式存在,约占总蛋白质的70%左右。结论pGEX-4T-1/AEP载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。     

可承载CETP多肽表位的颗粒样蛋白表达载体的克隆、表达与分离纯化

为了提高多肽表位的免疫原性，利用乙肝病毒核心抗原能够在体外自行组装成病毒样颗粒的特性，将人源胆固醇酯转运蛋白羧基端26个氨基酸连同大肠杆菌DnaK基因C端结构域克隆人乙肝病毒核心抗原的免疫优势决定区，并在大肠杆菌BL-21（DE3）表达，以包含体形式存在，经过洗涤、复性和分子筛纯化，获得纯度达90％以上的目的蛋白。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔后能够诱导产生高水平的抗胆固醇酯转运蛋白的抗体，表明乙肝病毒核心抗原能够在体外自发装配成多聚体颗粒，并能够将插入其免疫优势决定区的胆固醇酯转运蛋白（CETP）多肽表位展示于颗粒表面以提高免疫原性，显示出其作为疫苗免疫载体的良好前景。     

菊葛天麻颗粒挥发油的包结及表征

目的确定菊葛天麻颗粒挥发油与β-环糊精的包结工艺,分析测定包合物。方法以包结率和收得率为指标,采用正交L9(34)试验,优选包结条件;以X射线衍射法,对挥发油与β-环糊精形成包合物进行分析。结果挥发油与β-环糊精用量比为1∶10,包结温度为40℃,搅拌时间为3h,为挥发油与β-环糊精最佳包结条件,形成β-环糊精包合物。结论按实验确定的挥发油包结方法,可成功的将挥发油包结起来。