三维培养的牙髓干细胞参与牙髓损伤修复能力的实验研究

目的：将体外建立的细胞因子BMP-2作用下牙髓干细胞（DPSC）三维培养体系应用于大鼠牙髓损伤模型中,观察DPSC对牙髓组织损伤修复的能力。方法：已构建的三维培养DPSC的细胞团添加BMP-2体外持续培养7 d,BrdU标记及检测鉴定后,将其置于建立的大鼠牙髓损伤模型洞内,移植4周后HE染色,改良Mallory三色法染色观察,免疫组化检测BrdU标记的细胞分布。结果：移植后4周,DPSC三维细胞培养的牙髓盖髓实验中有骨样牙本质基质形成,没有观察到组织的炎症和坏死。在基质中可以看到骨性成牙本质样细胞,带有长的突起的成牙本质样细胞在骨性牙本质中形成管状牙本质。结论：损伤的牙髓表面植入添加BMP处理的DPSC细胞团能够产生修复性牙本质。     

Notch-2在大鼠牙髓炎中的时空分布及其意义

目的:研究单纯开髓导致大鼠牙髓炎进程中Notch-2在牙髓损伤修复中的作用.方法:通过开髓建立大鼠牙髓炎模型,用免疫组织化学染色方法研究Notch-2的时空表达变化及其意义.结果:牙髓损伤早期(3 d),牙髓间充质细胞和牙髓成纤维细胞中Notch-2均呈弱阳性表达,成牙本质细胞为阴性表达.牙髓损伤中期(5 d),靠近损伤区的成牙本质细胞深层细胞Notch-2阳性表达达到高峰;同时,新生毛细血管内皮细胞呈强阳性表达.牙髓损伤晚期(7 d),Notch-2在牙髓间充质细胞、血管内皮细胞中表达均减弱,而在成牙本质细胞阳性表达达到高峰.牙髓损伤末期(14 d),Notch-2仅在成牙本质细胞下层细胞中尚有微弱表达,而其余牙髓细胞均为阴性表达.对照组正常牙髓组织Notch-2表达为阴性.结论:Notch-2在牙髓损伤应激情况下在牙髓间充质细胞和成牙本质细胞中上调表达,对于启动牙髓自我修复、诱导牙髓间充质细胞功能性分化以及抑制受损成牙本质细胞凋亡、维系和调动其相对正常的生理功能可能具有重要作用.     

重编程相关因子在牙髓和牙周组织损伤修复中的表达和作用

目的:探讨重编程相关因子Oct-4、Sox2和c-Myc在大鼠牙髓组织和牙周韧带组织损伤修复过程中的表达及作用.方法:建立大鼠牙髓牙周联合损伤动物模型,HE染色观察4周后牙髓牙本质复合体及牙周附着装置修复情况,免疫组织荧光染色检测重编程相关因子Oct-4、Sox2和c-Myc在牙髓和牙周联合损伤修复动物体内模型的表达和分布.结果:HE染色显示,大鼠牙髓牙周联合损伤4周后,新生的牙髓牙本质复合体及牙周附着装置形成;免疫荧光显示,在体内牙髓牙周组织损伤修复的过程中,Oct-4、Sox2和c-Myc在牙髓及牙周损伤修复的新生组织均明显激活,Oct-4和Sox2呈现相似的表达趋势.结论:Oct-4、Sox2和c-Myc均参与体内牙髓牙本质复合体和牙周附着装置的损伤修复,Oct-4和Sox2呈现相似的表达趋势,提示Sox2和Oct-4可能存在协同调控作用,而c-Myc可能具备独立的功能.     

基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4在牙本质-牙髓复合体损伤修复过程中的表达

目的:通过构建牙本质-牙髓复合体损伤修复动物模型,研究基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4(SDF-1α/CXCR4)在其损伤修复过程中的表达。方法:制备大鼠牙本质-牙髓损伤模型,通过免疫组织化学染色、PCR技术分别对损伤后0、6h和1、3、7d及正常大鼠牙髓标本中SDF-1α/CXCR4进行检测。结果:正常大鼠组牙髓中没有发现SDF-1α、CXCR4阳性表达,实验大鼠组损伤6h后少量的成牙本质细胞和前期牙本质开始出现较弱阳性表达,损伤1d后成牙本质细胞阳性表达增强,损伤3d后牙髓成纤维细胞出现阳性表达,损伤7d后未分化间充质细胞出现阳性表达,大鼠牙髓损伤后SDF-1α、CXCR4随着时间的增加阳性表达程度明显增强。图像分析结果显示,SD大鼠牙本质-牙髓复合体损伤后牙髓中SDF-1α、CXCR4的表达(灰度值)除Oh外其余各组均高于对照组(P<0.05)。PCR结果显示,损伤后大鼠牙髓中SDF-1α、CXCR4均符合产物设计大小。其表达(灰度值)除Oh外其余各组均高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠牙本质-牙髓复合体损伤后,前期牙本质、成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞和未分化间充质细胞对SDF-1α、CXCR4的表达呈时间依赖性,提示SDF-1α、CXCR4可能参与了修复性牙本质的形成。     

骨髓间充质干细胞向牙髓组织迁移体内模型的构建

目的：构建一种骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）向牙髓等口腔组织迁移分化的体内模型,为进一步研究BMMSCs迁移、归巢机制从而诱导其修复、再生口腔组织奠定基础。方法：将第1代绿色荧光蛋白（Green flurensence protein,GFP）转基因小鼠的BMMSCs与野生型C57BL6小鼠的全骨髓细胞按一定比例混合后,尾静脉注射入亚致死量照射24h后的16只同品系小鼠体内（GFP-BMMSCs：2×105/只;BMCs：2×106/只）,28d后随机选取6只嵌合小鼠,检测其股骨BMMSCs中GFP＋BMMSCs细胞的比例。对同一处理组剩余小鼠右下颌磨牙牙髓施加刺激,7d后行多聚甲醛心脏灌注,并采集标本,常规脱钙处理后以自体左侧磨牙作为对照,组织学观察比较牙髓中荧光细胞数量改变。结果：嵌合模型股骨BMMSCs中GFP＋的比例为（76.32±3.46）%,口腔刺激侧牙髓中荧光细胞数量明显多于同一个体对照侧（P〈0.05）。结论：以荧光细胞作为示踪标记的骨髓移植动物可作为有效的研究模型探索骨髓间充质干细胞在体向牙髓等口腔组织迁移分化机制。     

颌突外胚间充质干细胞参与根尖缺损修复作用的研究

目的:探讨颌突外胚间充质干细胞参与根尖缺损修复的作用。方法:将外胚间充质干细胞复合锻烧骨后移植入大鼠根尖缺损处,以大鼠成纤维细胞复合煅烧骨、空白煅烧骨作为对照,1月后取材,经HE染色鉴定。结果:实验组修复的效果明显好于对照组,形成牙髓牙骨质样物。结论:提示移植的外胚间充质干细胞向该局部组织细胞分化,并参与根尖组织的修复。     

牙本质磷蛋白和成釉蛋白在组织工程牙胚的表达模式研究

目的：采用大鼠牙胚细胞与胶原蛋白构建组织工程牙齿,通过免疫荧光组织化学分析牙齿特异性蛋白在组织工程牙齿的表达模式。方法：采用出生后4dSD仔鼠磨牙牙胚细胞,培养后将牙胚细胞与胶原蛋白溶液混合构建组织工程牙胚,2W后取材,HE染色观察移植物中的成牙能力,免疫荧光组织化学染色观察牙本质磷蛋白DSP和成釉蛋白AM的表达模式。结果：组织工程牙胚移植后2W可在肾被膜下形成乳白色矿化组织,HE染色可见典型的牙髓牙本质复合体样组织和釉质样结构,免疫荧光组织化学染色观察可见成釉蛋白AM阳性的釉质样结构和牙本质磷蛋白DSP阳性的牙乳头样组织,与正常牙齿组织表达模式一致。结论：采用牙胚细胞可与胶原蛋白进行重新排列形成组织工程牙胚,本实验从组织和蛋白分析上证实了其具有较强的成牙能力,为以后的临床应用提供了理论基础。     

Notch 1信号蛋白在早期牙髓损伤修复中表达的免疫组化研究

目的 :通过建立大鼠牙髓损伤动物模型 ,观察Notch1信号蛋白在牙髓损伤修复过程中的表达。方法 :在大鼠第一磨牙牙合面开髓 ,分别对损伤后 2h、12h、2 4h、3d、7d及正常大鼠牙髓标本进行HE染色、免疫组化染色 ,检测各组标本中Notch1信号的表达。结果 :Notch1信号蛋白在正常成年大鼠牙髓组织中无表达 ,在牙髓损伤后表达上调。牙髓损伤 12h ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质中呈弱阳性表达。损伤后 1～ 3d ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质及接近损伤部位的牙髓细胞中呈阳性着色。损伤后 7d ,Notch1的表达位于成牙本质细胞层和穿髓孔下方的细胞增殖层。结论 :Notch1信号蛋白在大鼠牙髓损伤后早期阶段表达逐渐上调 ,随后在成牙本质细胞区及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ,并沉积于穿髓点附近的细胞增殖层。提示它可能在牙髓损伤的早期自身修复和牙本质矿化中起作用     

骨髓间充质干细胞联合纤维蛋白胶修复大鼠牙槽骨缺损的研究

目的 评价骨髓间充质干细胞(BMSCs)和纤维蛋白胶(FG)作为种子细胞和支架材料修复大鼠牙槽骨缺损的效果.方法 30只SD大鼠随机分成A、B组,建立SD大鼠上颌牙槽骨缺损模型,联合植入BMSCs和FG复合物,A组对照侧单纯植入FG,B组对照侧为空白对照.利用上颌骨实验区切片苏木精-伊红染色及Micro-CT扫描观察成...     

重建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的 采用组织工程学的方法重建牙本质-牙髓复合体样结构。方法以大鼠牙髓干细胞为种子细胞，将羟基磷灰石-磷酸三钙（HA-TCP）复合支架材料接种至裸鼠背部皮下，8周后取材进行组织学及免疫组织化学检测。结果移植物组织学切片可见支架材料孔隙内有3层组织结构，由外向内分别为矿化牙本质、前期牙本质及牙髓组织，其中牙本质小管明显，牙髓组织外层细胞密集，部分出现极化，呈现出成牙本质细胞样细胞特征。免疫组织化学染色证实人牙本质特异性蛋白、DMP1在前期牙本质区及成牙本质细胞样细胞为阳性表达。结论采用牙髓干细胞为种子细胞、HA-TCP为支架材料可成功构建牙本质-牙髓复合体样结构，为进一步进行牙齿组织工程再造奠定基础。     

早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究

目的：衬步探讨牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP)在早期早贿损伤修复中的作用。方法：制备大鼠牙髓损伤模型,分别对损伤后6h,12h,1d,2d,3d,7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色,检测各实验组标本中DSPP的表达。结果：正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳性着色;牙髓损伤后6h,12h,DSPP在成牙本质细胞层的染色明显减弱;损伤后1-3d,梁色较正常牙增强。此时,牙尖及富细胞区的牙髓细胞也有了性着色;损伤后7d,染色与正常对照无明显差异。结论：DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调;随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增强;7d时表达趋于正常。提示：它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。     

根管预备后的牙本质壁对兔骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:采用不同的处理方法改变根管内壁的微环境,观察根管内壁微环境的改变对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响。方法:收集患根尖周炎的离体牙,感染根管采用3种方法进行预备:A组机械预备后封三联抗生素,B组机械预备后封氢氧化钙,C组单纯化学预备后封氢氧化钙。将预备后的根管内壁分别与兔骨髓间充质干细胞复合进行体外培养,扫描电镜观察,检测细胞碱性磷酸酶活性。结果:3组均有细胞粘附于根管内壁生长;碱性磷酸酶活性染色,3组的阳性率分别为A组为2.39%、B组为32.59%、C组为31.10%。结论:骨髓间充质干细胞可以在根管经过机械预备或单纯化学预备后的牙本质壁上贴壁生长,氢氧化钙可促进细胞碱性磷酸酶的活性。     

大鼠骨髓间充质干细胞膜片的构建及其特性

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞膜片的构建和基本生物学特性。方法:从GFP-SD荧光大鼠体内提取原代骨髓并培养骨髓间充质干细胞(BMMSCs),鉴定后用于体外构建BMMSCs细胞膜片,用荧光显微镜、倒置显微镜和HE染色对膜片进行形态学检测,并提取膜片RNA用于RT-PCR实验,检测相关促愈合因子的表达情况。结果:BMMSCs成功分离、培养和鉴定。体外诱导培养2周后获得白色膜状细胞膜片,并可用机械力刮下。显微观察显示细胞呈长梭形重叠生长,染色显示细胞间紧密连接并分泌大量细胞外基质(ECM)。RT-PCR结果显示,膜片细胞与正常培养的BMMSCs相比,高表达TGF-β、FGF、VEGF和ColⅠ等细胞因子和蛋白,但在诱导1周和2周时的表达量无显著差异。结论:本方法能够较为稳定的在体外构建BMMSCs膜片,该膜片显著高表达TGF-β等促愈合因子。     

Stem cell‐based tooth and periodontal regeneration

Currently regeneration of tooth and periodontal damage still remains great challenge. Stem cell‐based tissue engineering raised novel therapeutic strategies for tooth and periodontal repair. Stem cells for tooth and periodontal regeneration include dental pulp stem cells (DPSCs), periodontal ligament stem cells (PDLSCs), stem cells from the dental apical papilla (SCAPs), and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs), dental follicle stem cells (DFSCs), dental epithelial stem cells (DESCs), bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs), adipose‐derived stem cells (ADSCs), embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). To date, substantial advances have been made in stem cell‐based tooth and periodontal regeneration, including dentin–pulp, whole tooth, bioroot and periodontal regeneration. Translational investigations have been performed such as dental stem cell banking and clinical trials. In this review, we present strategies for stem cell‐based tissue engineering for tooth and periodontal repair, and the translational studies.     

Challenges of stem cell‐based pulp and dentin regeneration: a clinical perspective

There are two types of approaches to regenerate tissues: cell‐based and cell‐free. The former approach is to introduce exogenous cells into the host to regenerate tissues, and the latter is to use materials other than cells in an attempt to regenerate tissues. There has been a significant advancement in stem cell‐based pulp and dentin regeneration research in the past few years. Studies in small and large animals have demonstrated that pulp/dentin‐like tissues can be regenerated partially or completely in the root canal space with apical openings of 0.7–3.0 mm using dental pulp stem cells, including stem cells from apical papilla (SCAP) and subpopulations of pulp stem cells. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and adipose tissue‐derived MSCs (AdMSCs) have also been shown to regenerate pulp‐like tissue. In contrast, the cell‐free approach has not produced convincing evidence on pulp regeneration. However, one crucial concept has not been considered nor defined in the field of pulp/dentin regeneration and that is the critical size defect of dentin and pulp. Without such consideration and definition, it is difficult to predict or anticipate the extent of cell‐free pulp regeneration that would occur. By reasoning, cell‐free therapy is unlikely to regenerate an organ/tissue after total loss. Similarly, after a total loss of pulp, it is unlikely to regenerate without using exogenously introduced cells. A cell homing approach may provide a limited amount of tissue regeneration. Although stem cell‐based pulp/dentin regeneration has shown great promise, clinical trials are difficult to launch at present. This article will address several issues that challenge and hinder the clinical applications of pulp/dentin regeneration which need to be overcome before stem cell‐based pulp/dentin regeneration can occur in the clinic.     

Dentin regeneration using deciduous pulp stem/progenitor cells

Reparative dentin formation is essential for maintaining the integrity of dentin structure during disease or trauma. In this study, we investigated stem/progenitor cell-based tissue engineering for dentin regeneration in a large animal model. Porcine deciduous pulp stem/progenitor cells (PDPSCs) were mixed with a beta-tricalcium phosphate (β-TCP) scaffold for dentin regeneration. Different concentrations of PDPSCs were tested to determine the optimal density for dentin regeneration. Aliquots of 5×10(5) PDPSCs in 1 mL resulted in the highest number of cells attached to the scaffold and the greatest alkaline phosphatase activity. We labeled PDPSCs with green fluorescent protein (GFP) and used the optimal cell numbers mixed with β-TCP to repair pulp chamber roof defects in the premolars of swine. Four weeks after transplantation, GFP-positive PDPSCs were observed in PDPSC-embedded scaffold constructs. At 16 weeks after transplantation, the PDPSCs mixed with β-TCP significantly regenerated the dentin-like structures and nearly completely restored the pulp chamber roof defects. This study demonstrated that the PDPSC/scaffold construct was useful in direct pulp-capping and provides pre-clinical evidence for stem/progenitor cell-based dentin regeneration.     

同期神经化增强髂骨瓣术后骨髓间充质干细胞的活性

目的： 比较神经化髂骨瓣和传统髂骨瓣重建下颌骨缺损术后,移植骨块骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）的干细胞活性。方法： 游离血管化髂骨瓣移植修复下颌骨缺损术后半年,从移植骨骨髓体外分离、培养BMMSCs,通过集落形成观察、Brdu摄入实验、群体倍增时间、体外成骨茜素红染色法、裸鼠皮下成骨法检测BMMSCs增殖、自我更新及成骨分化能力。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 神经化髂骨移植术后分离、培养的BMMSCs的集落形成、增殖、群体倍增时间、体外及体内成骨分化能力均显著高于非神经化组（P<0.05）。结论： 神经化髂骨瓣重建下颌骨缺损可以增强BMMSCs的自我更新、增殖、成骨分化等潜能,有助于维持移植骨的术后内环境稳定,减少术后移植骨吸收。     

不同来源骨髓间充质干细胞成骨能力的比较

目的 比较人不同来源骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的骨向分化能力,为骨组织工程筛选种子细胞提供一定的理论基础.方法 体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JMMSCs);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨来源骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs).流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记,成骨分化诱导后茜素红染色检测细胞矿化能力,成骨分化诱导后qRT-PCR及Western Blot检测细胞成骨相关分子:Runx2、1型胶原(Collagen Type 1,COL-1)、OCN.结果 JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD90、CD105,阴性表达CD34、CD14、CD45.成骨分化诱导21 d后,茜素红染色显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs.成骨诱导7 d、14 d、21 d后,JMMSCs成骨相关分子在基因和蛋白水平上均强于BMMSCs.结论 与BMMSCs相比,JMMSCs成骨分化能力较强,颌骨骨髓可能更适于用作骨组织工程的成体干细胞来源.     

牙髓干细胞修复再生同质异体大鼠牙髓牙本质复合体的研究

目的:观察第3代同质异体牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSCs) 定植于冠髓被摘除的大鼠髓腔后,再生修复牙髓牙本质复合体的能力。方法:18只SD大鼠随机分为实验组和对照组,两组均全麻下摘除大鼠上颌双侧第一磨牙冠髓,实验组同期髓腔定植体外培养的同质异体大鼠牙髓干细胞,对照组冠髓摘除后不进行任何处理,术后均使用光固化树脂充填封闭髓腔。两组动物均于术后2、4、6周处死,取其上颌骨进行大体观察,X线观察,组织学观察,牙本质的厚度测量。结果:实验组4周时,肉眼可见牙髓充血减少;6周时,X线显示牙本质厚度增加,根尖孔闭合;6周时,光镜下显示明显新生牙本质形成,成牙本质细胞栅栏状排列;牙本质厚度测量结果显示,实验组牙本质厚度2周时增厚,4周增厚更明显,持续至6周,优于对照组(P<0.05)。结论:牙髓干细胞髓腔内定植,可以促进牙髓牙本质复合体修复再生,具有潜在的临床应用价值。