葎草及豚草过敏原嵌合基因的创建及其抗原性评价

目的 构建一种嵌合过敏原，同时保有葎草和豚草过敏原的特征，而其抗原性得到改变。方法 以业经克隆到葎草和豚草过敏原基因片段的混合物为模板，利用桥式PCR和重叠引物法，扩增得到嵌合基因，利用测序、蛋白表达及抗原性分析软件对所得嵌合基因编码蛋白与MHCⅡ类分子的结合表位进行评价。结果 通过以上方法获得嵌合基因3例，序列分析表明，3例嵌合基因AL03-1、AL03-2及AD03-4分别与原始克隆LCM9、LCS13（LCM20）及D03具有较高的同源性，而其抗原性分别比相似的原始克隆略强、略强及明显增强，融合表达带型与原始克隆的也基本一致。结论 采用桥式PCR及重叠引物法，嵌合基因及其表达载体得到成功构建，所得的嵌合基因将满足不同体质或不同免疫力的人群、不同免疫治疗阶段的脱敏治疗的临床需要。     

嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究

目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应。方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliCi及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliCi的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esa。t将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒。将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat。以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达。以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过W estern b lot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白。以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平。此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELIS...     

羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定

本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础。用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期。结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础。     

抗CD20嵌合抗体的构建与表达

目的构建抗CD20嵌合抗体的真核表达载体并实现在真核细胞中的表达。方法采用RT-PCR,从分泌鼠源抗人CD20抗体的杂交瘤细胞系1-28中钓取其轻、重链基因,连接至T载体,进行序列测定。还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗CD20单克隆抗体(mAb)1-28的轻、重链蛋白,切取轻链及重链条带,质谱测定氨基酸序列,Biolynx和pepeseq软件分析可信度。对比所测DNA序列与蛋白序列,确定所钓取基因的正确性。将mAb1-28轻重链可变区基因,连接至表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体C1-28的轻链真核表达载体C1-28L及重链真核表达载体C1-28H。PCR、酶切及序列测定以确定连入基因的正确性。脂质体介导法将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,RT-PCR检测mRNA水平的表达,夹心ELISA法检测蛋白表达量,Westernblot检测目的蛋白的大小。结果钓取到mAb1-28基因。mAb部分蛋白序列测定结果与根据所钓取基因推出的蛋白序列相对应。成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达,表达量可达257mg/L,其相对分子质量(Mr)与人IgG的Mr一致。结论为后续研究嵌合抗CD20抗体对非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了一定的依据。     

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链的真核表达

目的:在Sp2/0细胞中表达抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链.方法:采用RT-PCR技术从稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体(mAb)的小鼠杂交瘤细胞中扩增抗体轻链可变区基因VL, 并构建到人-鼠嵌合轻链表达载体pAG4622.重组质粒pAG4622/VL经DOTAP试剂转染入Sp2/0细胞, 酶酚酸筛选后用ELISA和RT-PCR检测表达产物.结果:在筛选后的转染细胞上清中检测到抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链蛋白, 且其细胞中存在相应嵌合轻链mRNA.结论:嵌合轻链的稳定表达, 为后续抗人L-PGDS人-鼠嵌合抗体的获得奠定基础.     

Bcr/abl嵌合基因表达与慢粒白血病细胞积累

目的和方法 :ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因是定位于人 9号染色体 9ｑ34上的ｃ -ａｂｌ基因和 2 2号染色体 2 2ｑ1 1上的ｂｃｒ基因因ｔ( 9:2 2 )易位 ,使相应断裂的基因发生融合所形成。它是ｐｈ染色体的分子基础 ,在慢粒白血病 (ＣＭＬ)发病中起重要作用。Ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因编码具酪氨酸激酶活性的蛋白 (Ｐ2 1 0 )。这种蛋白与细胞信号传导蛋白相互作用 ,扰乱细胞信息传递过程 ,使ＣＭＬ细胞增殖和分化失控。为了探讨ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因表达致慢粒白血病细胞积累的发病机制 ,设计并合成针对ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因的反义寡脱氧核苷酸 (ａ …     

四种GRP78-靶向肽-GC3M-Fcα Ra.1新型嵌合免疫受体的组建研究

嵌合免疫受体是一类在体外通过基因重组方法而建立的一种能识别特异性靶抗原的免疫受体。运用从噬菌体表面展示技术筛选出的能与GRP78高亲和力结合的靶向肽段做为抗原识别段,同时将膜结合型IgG3蛋白的Hinge-CH2-CH3做为连接穿膜段,并首次将FcαRa.1(CD89)分子的胞内部分做为胞内信号转导段组建了四种新型免疫嵌合受体,将其中一种嵌合受体转入U937细胞系,并使其获得了部分识别杀伤其他肿瘤细胞的能力。     

MRSA耐药相关TG-TPase嵌合基因的原核表达与纯化

目的 设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TGTPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础.方法 通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用LPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Westem blotting鉴定.小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化.结果 从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%.融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上.结论 成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础.     

人乳头瘤病毒6b L1/16E7嵌合蛋白的基因克隆和表达

目的 研究HPV6bL1/16E7嵌合蛋白的基因克隆及其在昆虫细胞的表达,为防治尖锐湿疣和宫颈癌的基因工程疫苗研究作准备。方法 用PCR扩增出HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达HPV6bL1/16E7嵌合蛋白。结果 HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因在昆虫细胞中得到了表达,并可自组装形成病毒样颗粒。结果 昆虫细胞表达的HPV6bL1/16E7嵌合病毒样颗粒可进一步用于HPV感染的免疫机理及基因工程疫苗研究。     

AAV2-BPI700-Fcγ1700重组病毒的制备及其转染小鼠后的抗感染作用

目的 通过观测BPI700-Fcγ1 7001嵌合基因导入小鼠对最小致死量E．coli感染攻击的抵抗作用，探讨基因治疗在细菌感染性疾病中应用的可能性。方法采用RT-PCR检测嵌合基因在转录水平的表达；采用免疫组化和酶联免疫吸附实验检测嵌合基因在蛋白水平的表达。结果（1）基因导入小鼠中目的嵌合基因得到表达，在注射部位肌肉组织和血清中可检测到目的嵌合蛋白；（2）在最小致死量E．coli感染攻击后，基因导入小鼠的存活率为31．43％，明显高于对照组小鼠的存活率4．62％；与小剂量头孢呋辛钠联合应用其存活率高达65％。结论BPI700-Fcγ1 700嵌合基因导入小鼠对致死量E．coli感染具有较好抵抗作用，提示抗感染基因治疗在细菌感染性疾病，特别是在感染高危人群中具有广阔的临床应用前景。     

嵌合基因在肿瘤发生中的作用

基因嵌合现象普遍存在于各种癌症中,嵌合基因（chimeric gene）和蛋白在肿瘤发生中发挥重要作用。嵌合基因在人类多种疾病,特别是癌症中过度表达,但分子机制并不明确。近年来,有关嵌合基因的分子机制逐渐清晰,人们对发病较高的前列腺癌、肺癌以及白血病中过度表达的嵌合基因进行深入探索,也为未来肿瘤的诊断和治疗提供非常重要的理论依据。     

过继T细胞免疫治疗的临床应用研究进展

过继T细胞免疫治疗是一种新的肿瘤治疗方法,其中细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞技术是目前临床开展应用最多的一种过继免疫细胞治疗;而基因修饰的T细胞,即T细胞受体修饰的T细胞和嵌合抗原受体修饰的T细胞技术则是目前过继免疫细胞治疗的热点,已从基础研究开始转变为临床应用,尤其是嵌合抗原受体修饰的T细胞,由于其汇集单克隆抗体技术、疫苗技术、细胞免疫技术的优势于一体,在血液病的临床应用中显示出其显著的治疗效果,并且已被逐步扩展到实体瘤临床应用方面,本文简要综述了三种过继免疫细胞治疗的原理及临床应用。     

免疫PCR:通过特异性抗体-DNA缀合物高敏感性检测抗原

免疫PCR方法的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子,使作为标志物的DNA分子特异性地结合到抗原-抗体复合物上,形成一种特异性抗原-抗体-DNA缀合物,附着的DNA标志物可用适宜的引物进行PCR扩增,特异性PCR产物的存在证明DNA标志物分子特异性地附着于抗原-抗体复合物上,进而证明有抗原存在。在此方法中,链霉亲和素-蛋白A(SPA)嵌合蛋白被用作连接分子,链霉亲和素-SPA具有两种不同的特异结合能力,即链霉亲和素对生物素的结合力和SPA对坛IgG Fc段的结合力。这种对生物素和抗     

抗癌胚抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及鼠-人嵌合抗体基因在E.coli中的高效表达

本文采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从抗癌胚抗原（CEA）单克隆抗体杂交瘤细胞中克隆到了该抗体的重、轻链可变区（Ⅴ区）基因,并分别将其与人的恒定区基因 C_(3γ)、C_κ相拼接,构建鼠-人嵌合抗体基因。SDS-PAGE和Western-Blot分析结果证实嵌合重、轻链抗体基因在E.coli中得到高效表达,表达量约为菌体可溶蛋白的30％和15％。放射免疫分析法（RIA）和间接ELISA测定的结果表明嵌合重链基因表达产物具有与CEA结合的能力。     

肿瘤坏死因子α拮抗剂的研究进展

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的过量表达与很多疾病密切相关，应用TNF-α的拮抗剂降低这些疾病中的TNF-α水平，将成为一种有效的治疗措施。已开发的TNF-α拮抗剂主要包括TNFR与IgG的Fc段形成的融合蛋白和抗TNF-α的单抗两大类，利用抗体嵌合技术、CDR区移植和噬菌体展示技术对抗TNF-α的单抗进行了人源化，并开展了对类风湿性关节炎和结肠Crohn病等免疫性疾病的临床试验研究。本文就这些TNF-α拮抗剂的研究进展作一综述。     

乙肝病毒核心区与"a"决定簇嵌合基因的体外表达及抗原性分析

目的评价乙肝病毒核心区与"a"决定簇嵌合基因表达产物的抗原性.方法应用基因工程技术将编码截短的乙型肝炎病毒核心抗原的主要免疫显性区替换为表面抗原"a"决定簇的基因片段,将嵌合基因装入原核表达载体pRESET-B内,在体外进行诱导表达,纯化目的蛋白并检测其抗原性.同时将嵌合基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3内,瞬时转染 BHK细胞并采用间接免疫荧光法检测融合蛋白表达情况.结果诱导并纯化得到了分子量为28 ku的蛋白,经检测证实该蛋白具有一定的HBsAg抗原性和较弱的HBcAg抗原性.真核表达质粒可在 BHK细胞内表达,可检出良好的HBsAg抗原性及较弱的HBcAg抗原性.结论该嵌合质粒表达产物具有良好的HBsAg抗原性及较弱的HBcAg抗原性.     

体外突变新技术:DNA Shuffling技术

体外 DNA shuffling技术是一种快速、高效并且实用的分子定向进化技术。和以往的基因突变技术不同 ,它是一种高通量的突变筛选技术 ,可以对靶序列进行多次重组和选择 ,利用该技术建立的突变文库 (嵌合文库 )具有容量大、多样性好等优点 ,且更易于实现有益突变的积累。DNA shuffling技术已广泛应用于酶、药物蛋白及其它功能蛋白的改造 ,并取得了相当大的成功 ,显示了该技术在蛋白质改造和分子育种方面的潜在应用价值     

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的：构建抗CD71人-鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法：将鼠源性抗CD71单抗(7579)重、轻链可变区基因(VB和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ-Expr和pκ-Expr中；将嵌合表达载体(Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr)经电转染技术共转染至真核细胞(SP2／0)中。结果：经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清，证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区(pγ)和轻链恒定区(Cκ)蛋白；通过间接免疫荧光流式细胞术(FCM)和间接免疫荧光显微技术，证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CC71分子。结论：抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)在体外真核细胞表达成功。     

人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a( ),获得pET28a( )-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.