Pre-miR-10a重组腺病毒载体对K562细胞增殖的抑制作用

目的:观察在K562细胞高表达miR-10a对细胞增殖及凋亡的影响。方法:用pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体感染K562细胞,采用RT-PCR检测感染后K562细胞中miR-10a和bcr/abl融合基因的表达水平,Western blot法检测BCR/ABL融合蛋白表达水平,MTT、流式细胞术(FCM)分别检测感染后K562细胞的增殖及凋亡。结果:与对照组相比,K562细胞在转染pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体后,其miR-10a表达水平明显升高、bcr/abl融合基因水平显著降低;BCR/ABL融合蛋白表达明显下调、K562细胞增殖活力被抑制、细胞凋亡增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体能明显抑制K562细胞的增殖、促进细胞凋亡。     

慢性粒细胞白血病和原发性骨髓纤维化患者bcr/abl融合基因表达及临床意义

目的探讨bcr/abl融合基因的表达水平在慢性粒细胞白血病(CML)和原发性骨髓纤维化(MF)患者的诊断、疗效及预后观察中的意义.方法采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,对18例初、复治CML、7例MF患者的骨髓或外周血单个核细胞进行了bcr/abl融合基因检测,并对其中2例行异基因骨髓移植(allo-BMT)患者进行了短期随防.结果 13例慢性期(CP)CML,12例不同程度表达bcr/abl融合基因,占92.3%,3例加速期(AP),急变期(BC)CML,2例表达bcr/abl融合基因,占66.7%,2例患者allo-BMT后一年内未检出 bcr/abl融合基因,三者之间有非常显著差异P＜0.01;8例初诊患者WBC数及bcr/abl融合基因表达水平明显高于常规治疗组;7例MF患者有1例表达bcr/abl基因.结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义;MF患者可能与CML关系密切,对MF患者应进行跟踪观察.     

bcr/abl融合基因与慢性粒细胞白血病急变

目的探讨bcr/abl融合基因的表达在CML急变中的意义。方法采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(FQ-PCR)技术，对9例CML患者急变前后的血或骨髓进行bcr/abl检测。结果 CML患者从慢性期到急变期往往伴随着bcr/ablmRNA水平的明显升高。结论bcr/abl是CML发病的分子基础，定量检测bcr/abl融合基因对于CML急变的诊断，疗效观察及预后有重要意义。     

骨髓增殖性疾病Bcr／Abl融合基因的表达及其意义

目的：为探讨几种骨髓增殖性疾病bcr／abl 融合基因出现的频率及临床意义．方法：采用逆转录多聚酶键反应（RT－PCR）技术,研究了慢性粒细胞白血病（CML）,真性红细胞增多症（PV）,原发性血小板增多症（ET）,原发性骨髓纤维化（MF）bcr／abl基因的变化．结果：48例慢性期CML,43例呈现bcr／abl基因阳性,占90％,14例加速,急变期CML,6例出现bcr／abl基因,阳性率为43％,与慢性CML相比P＜0.01;10例PV出现1例bcr／abl基因阳性,占10％,6例ET中未发出bcr／abl基因．2例MF中发现1例bcr／abl基因阳性．结论：bcr／abl基因检测对于CML的临床分型有重要意义,bcr／abl阴性的CML预后差,而bcr／abl基因的阳性有助于初诊时的CML急变与急性非淋巴细胞白血病（AML）M2的鉴别和CML与慢性粒单细地白血病（CMML）的鉴别．在其它三种骨髓增殖性疾病中MF可能与CML关系最为密切,而ET关系较远,少数PV可能转化为CML．     

慢性髓系白血病bcr-abl融合基因的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆慢性髓系白血病(CML)融合基因bcr abl的cDNA序列 ,并在真核细胞中表达。方法以设计的两条引物扩增bcr abl融合位点两侧的cDNA ,测序后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1 ,转染COS 7细胞。取常规培养的细胞进行RT PCR鉴定。结果①PCR扩增出490bp大小的cDNA ,其序列测定除第452位的碱基C突变为T外 ,其余序列均正确。②RT PCR法检测到转染细胞系中 ,有bcr ablmRNA的表达。结论成功地克隆了CML融合基因bcr abl融合位点两侧的490bp 序列并表达 ,为研制bcr abl基因疫苗治疗CML奠定了基础。     

熊果酸促进K562细胞凋亡

本研究旨在探讨熊果酸在体外对人红白血病K562细胞系的作和机制。采用MTT法和流式细胞术检测熊果酸对K562细胞的增殖抑制和杀伤效应;用慧星电泳分析熊果酸对K562细胞DNA的损伤;Hoechst33258荧光染色观察DNA片段化：细胞免疫化学染色检测Bcl-2和Bax的表达;Western blotting检测K562细胞内Caspase-3和磷酸化酪氨酸的表达和活性。结果显示熊果酸存在体外对K562细胞具有中度增殖抑制效应,并呈浓度和时间依赖性。在熊果酸作用下K562细胞呈现凋亡征象,同时细胞内Bcl-2表达下降,Bax表达升高,Caspase-3被激活,磷酸化酪氨酸表达下降,说明熊果酸存体外对K562细胞有诱导凋亡作用,而提高Bax的表达、诱导Caspase-3活化及降低BCR／ABL的酪氨酸激酶活性可能足其作用机制之一。     

慢性髓性白血病患者β-catenin的表达及其临床意义

目的:比较β-catenin在慢性髓性白血病(CML)各期中的表达情况,并分析与bcr/abl及伊马替尼细胞遗传学疗效的关系,为探讨CML疾病进展机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据。方法:采用RT-PCR和Western blotting方法,检测99例CML患者骨髓单个核细胞中β-catenin mRNA和蛋白质水平的表达,分析与bcr/abl的相关性;94例CML患者服用伊马替尼1年后FISH检测bcr/abl融合基因,分析β-catenin与伊马替尼细胞遗传学疗效的关系。结果:CML急变期、加速期患者β-catenin的表达明显增高(P0.01),而慢性期与正常人无明显差别(P0.05);β-catenin与bcr/abl表达水平无明显相关性(r=0.314,P0.05);未达主要细胞遗传学缓解的CML患者β-catenin明显增高(P0.01)。结论:CML疾病进展阶段β-catenin的表达明显升高,β-catenin的表达与bcr/abl无明显相关,而与伊马替尼疗效有关,β-catenin可能参与CML疾病进展机制,可作为新的治疗靶点。     

酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼对PTEN介导的K562细胞侵袭的影响

目的:研究酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼对K562细胞PTEN信号转导的调控,以及对细胞侵袭功能的影响.方法:不同浓度甲磺酸伊马替尼作用K562细胞不同时间后,通过荧光定量PCR检测BCR/ABL、PTEN、FAK水平变化及相互关系,免疫细胞化学染色检测FAK蛋白水平,Transwell小室检测K562细胞侵袭功能.结果:2μg/mL甲磺酸伊马替尼作用K562细胞在36 h内,随着BCR/ABL融合基因表达减低,PTEN mRNA表达上调,FAK mRNA及蛋白表达下调,K562细胞侵袭功能明显减弱.作用48 h后,随着BCR/ABL融合基因的抑制减弱,PrEN表达进而减低,而FAK表达升高.BCR/ABL mRNA与PTEN mRNA呈负相关趋势,与FAK mRNA呈正相关趋势.结论:甲磺酸伊马替尼通过抑制BCR/ABL融合基因调控PTEN/FAK信号转导通路,参与抑制白血病K562细胞侵袭作用.     

阿糖胞苷上调耐药白血病细胞共刺激分子表达及其分子机制研究

目的研究阿糖胞苷（Ara-c）对耐药白血病细胞共刺激分子表达的影响，并探讨其分子机制。方法以流式细胞术检测K562和K562／A02细胞经Ara-C处理后CD80、CD86分子的表达，进而用RT-PCR方法检测CDS0、CD86mRNA表达以及NF-κB、IAP家族基因表达。结果经Ara-C处理后，K562和K562／A02细胞的CD80、CD86分子表达较对照组明显升高，并且能够下调NF-κB、Survivin、XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis）基因表达，而cIAP1、cIAP2（cellular inhibitor of apoptosis-1，2）基因表达变化不明显。结论Ara-C可上调耐药白血病细胞共刺激分子CD80、CD86，相关基因NF-κB、IAP家族为参与其上调CD80和CD86分子的重要基因。     

25例慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的探讨逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)在检测慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因方面的应用价值。方法对25例慢性粒细胞白血病患儿血标本提取细胞RNA,用RT—PCR方法检测bcr/abl融合基因。结果 25例慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因分析,阳性24例(96%);阴性1例(4%)。结论 RT—PCR检测bcr/abl融合基因敏感性好,稳定性高,对临床治疗和预后判断具有指导意义。     

荧光原位杂交检测慢性粒细胞白血病的染色体畸变

目的 检测费城染色体（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，Ｐｈ染色体）阴性，变异型Ｐｈ染色体及伴有其它染色体异常的慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因。方法 双色荧光原位杂交技术，检测伴有８种不同的骨髓细胞染色体畸变ＣＭＬ患者的ｂｃｌ／ａｂｌ融合基因。结果 ３例变异型Ｐｈ和７例有标准型Ｐｈ的ＣＭＬ患者均为ｂｃｒ／ａｂｌ融合     

小檗胺诱导K562细胞凋亡及其与bcr/ablgene及P210表达的关系

目的:探讨小檗胺(BER)诱导K562细胞凋亡及其可能的机制。方法:以流式细胞仪(FCM)分析、电镜观察细胞微结构变化及基因组DNA电泳等方法检测细胞凋亡。以RT-PCR及Westernblot方法检测K562细胞BCR/ABLmRNA和蛋白质水平表达。结果:FCM检测见到典型的凋亡峰,8.0mg/LBER作用24-72h,随药物作用时间延长,细胞凋亡率由(29.20±3.82)%上升至(61.77±4.35)%(P＜0.01);以2.0-8.0mg/LBER作用24h,随药物浓度增加,K562细胞的凋亡率也增加。电镜下可见明确的细胞凋亡的形态学改变。DNA电泳呈现典型的梯形条带。16.0mg/LBER处理24h,K562细胞bcr/ablmRNA相对表达量及BCR/ABL融合蛋白质P210水平均明显低于对照组,分别为0.73±0.02vs1.19±0.02(P＜0.01)和0.63±0.01vs1.04±0.02(P＜0.01),呈时间-浓度依赖效应。经BER作用后,K562细胞bcr/ablmRNA表达强度与P210水平呈正相关(r=0.928,P＜0.05),且细胞凋亡率与bcr/ablmRNA表达呈负相关(r=-0.997,P＜0.01)。结论:在体外BER对K562细胞有明显的促凋亡作用,抑制bcr/ablmRNA表达及其蛋白质水平可能是其作用的重要机制之一。     

Short-term culturing influences the number of bcr/abl-fused cells detected by fluorescence in situ hybridisation in bone marrow aspirates of CML patients.

Fluorescence in situ hybridisation (FISH) has been proven as a helpful tool in diagnosis and monitoring of bcr/abl fusion in chronic myelogeneous leukaemia (CML). Since long-term cultures are known to decrease the number of bcr/abl-fused cells, it is questionable whether similar effects are detectable in short-term cultures, a technique often preceding FISH analysis. Therefore, we evaluated bone marrow aspirates of 10 CML patients at biopsy and after culturing for between 24 and 144 h by FISH. The percentage of bcr/abl-fused cells in FISH varied between 15 and 70% at biopsy. In samples with 15 and 30% of aberrant cells at biopsy, an increase of about 20% per day was seen within the first 48 h. In longer lasting cultures, the percentage of leukaemic cells then asymptotically approached a value of 60-70%. In patients with 38 and 50% of bcr/abl-fused cells at biopsy, an increase of about 20% could be detected in the first 24 h. Then 65-70% of the cells already bore the bcr/abl fusion, and the percentage of leukaemic cells was almost constant for longer lasting cultures up to 144 h. In patients with a percentage of about 70% before culturing, no increase in positive cells was detected. These results emphasize the impact of short-term culturing on the number of bcr/abl-fused cells. In particular, the importance for monitoring CML patients is obvious. Therefore the effect described should be taken into account in order to avoid misinterpretation and incorrect therapy decisions in CML patients.     

慢性粒细胞白血病特异性单、双及三单位核酶载体的构建

本文拟针对在慢性粒细胞白血病发病中起关键作用的ｂｃｒａｂｌ 融合基因, 构建特异性的系列核酶载体。为此,我们针对ｂｃｒａｂｌ 融合位点设计、合成了３ 个相邻的锤头状核酶。通过基因重组将３ 个单核酶按顺序定向克隆入改建的ｐＧＥＭ３ｚｆ 载体中,构建了ｂｃｒａｂｌ 单核酶、双核酶及三核酶体外转录载体, 并在此基础上将三单位核酶克隆入ｐ ＤｏＲｎｅｏ 载体中构建三核酶逆转录病毒载体。此外, 通过ＰＣＲ 方法, 扩增了ｂｃｒａｂｌ 融合位点附近约３７６ｂｐ 的序列,成功地构建了ｂｃｒａｂｌ 融合基因体外转录载体。本文构建的ｂｃｒａｂｌ 特异性系列载体,为今后遴选特异、高效的核酶打下了基础,并为将核酶用于自体骨髓移植的体外骨髓净化创造了条件。     

PTD—bcr／abl融合癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

目的 探讨蛋白转导结构域（PTD）介导的转导bcr/abl癌蛋白片段的方法,为进行免疫治疗提供实验依据。方法 合成编码PTD的基因片段,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋bcr/abl基因片段融合,在胸有成竹肠杆菌中表达,将纯化的融合蛋白PTD-bcr/abl与HL-60细胞共孵育,用Western blot分析融合蛋白的跨膜转运。结果 PTD基序可介导bcr/abl蛋白由细胞外跨膜转导进行细胞内。结论 这一结果可能为应用外源蛋白负载（loading)抗原提呈细胞（APC）提供新的途径。     

Real-time PCR quantification of bcr/abl chimera and WT1 genes in chronic myeloid leukemia

Quantification of mRNAs deriving from malignant cells is useful for estimating leukemic states. In this study, we have developed RT-PCR methods using real-time PCR detection system, a LightCycler, for quantification of bcr/abl chimerical genes in peripheral blood and bone marrow of chronic myeloid leukemia patients. Total amounts of RNA extracted were corrected using beta-actin gene as an internal standard. The coefficients of variation of intra-assay variation and inter-assay variation for each gene were within a range of 1.7-26.0% which showed more precise quantification than the competitive PCR method. The coefficients of variation of assay are within a range of 7.7-27.6% in the case of using three samples of normal subjects from blood collecting to quantification of bcr gene. Bcr/abl and WT1 genes could be measured from 10(2) to 10(8) copies and 10 to 10(5) copies with linearity, respectively. Using real-time PCR detection with LightCycler system, 2 x 10(3) K562 cells among 2 x 10(6) total cells demonstrated the bcr/abl gene, while 2 x 10(1) K562 cells among 2 x 10(6) total cells could be detected using the nested PCR method. In tests of seven clinical samples, five samples demonstrated bcr/abl and WT1 genes, while those in two other patients after bone marrow transplantation and a normal subject could not detected. This result suggests that our quantitative method reflect the clinical stages of CML patients.