hBDNF基因在成纤维细胞中的异位表达

将hBDNF全长编码序列插入人Ⅰ型胶原基因（Colia1）增强子－启动子调节序列之下，构建了含Colia1-BDNF微基因的重组pSCEPBFCAT，并转染人胚肌腱成纤维细胞。成功地利用了Colia1基因调控元件介导DBNF基因在成纤维细胞中异位表达，SDS－PAGE显示表达产物分子量为27kDa，免疫斑点杂交、Elisa和Western杂交证实该表达产物具有BDNF抗原活性。     

单纯疱疹病毒I和Ⅱ型共同抗原gD在大肠埃希菌中的重组表达

目的 克隆人单纯疱疹病毒I、Ⅱ（HSV－I、Ⅱ）型共同性抗原gD基因，构建重组表达载体pMAL-c2/gD,诱导融合蛋白MBP－gD的表达。方法 提取病毒DNA，PCR扩增出gD基因，克隆于原核表达载体pMAL-c2并转化大肠埃希菌DH5α。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后，IPTG诱导表达融合蛋白MBP－gD，并进行免疫学鉴定。结果 构建的重组表达质粒pMAL-c2/gD在大肠埃希菌中能高效表达。经SDS－PAGE分析，表达产物约占菌体总蛋白35．5％，其中39％以可溶蛋白形式存在于胞质中，61％以包涵体形式存在。结论 构建了pMAL-c^2/gD表达质粒，Western blot证实，HSV－I gD单克隆抗体DL6可特异识别表达的gD蛋白，该蛋白具有天然gD的抗原性。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

可溶性CD14突变体的构建与表达研究

目的 将人CD14信号转导启动区97－101氨基酸进行丙氨酸置换突变。,构建直核表达质粒,并在COS－7细胞中进行表达。方法 采用两轮聚合酶链反应定点突变方法,对人可溶性CD14推测中的LPS信号转导启动区之一,N端97－101氨基酸用丙氨酸进行置换交换。将突变PCR片段克隆至载体pGEM-T,进行酶切鉴定及序列分析。将突变基因亚克隆至真核表达质粒pClneo中,转染COS－7细胞进行瞬时表达,并用SDS－PAGE和Western blot检测表达蛋白。结果 测序结果证实,CD14的N端97－101氨基酸发生了连续丙氨酸置换突变。SDS－PAGE表明,突变体基因在COS－7细胞中得到瞬时表达。Western blot显示,抗CD14多克隆抗体可与重组表达的突变体蛋白特异性结合。结论 成功地构建并表达CD14 97－101氨基酸丙氨酸置换突变体,为研究CD14信号转导缺失突变体的生物学活性与功能打下了基础。     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定

目的：构建含鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1的重组载体，并在酿酒酵母中表达。方法：将鼠疫杆菌的F1抗原结构基因caf1插入到pHSS6-mTn-3xHA／locz质粒中，构建重组载体pHSS6-mTn-3xHA／locz—caf1。将重组载体经NotⅠ酶切后，以醋酸锂法转化酿酒酵母，将转化的酿酒酵母接种于SCUra平板上筛选阳性克隆，表达产物用SDS—PAGE和Western blot进行鉴定。结果：经SDS—PAGE鉴定和Western blot分析表明，转化的酿酒酵母可表达鼠疫杆菌F1表面抗原蛋白。结论：成功地构建了重组载体pHSS6-mTn-3xHA／lacZ—caf1，并在酿酒酵母中稳定表达鼠疫杆菌F1表面抗原，为制备可经消化道途径免疫的鼠疫杆菌基因疫苗奠定了基础。     

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的 克隆MAGE－3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况；重组表达MAGE－1和MAGE－3抗原，用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究。方法 RT－PCR法检测了MAGE－3在人食管癌组织中的表达情况。采用DNA重组技术将MAGE－1和MAGE－3全长cDNA克隆至pET30a( )载体上，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，经SDS－PAGE和western blot鉴定后，制备其可溶性蛋白，研究其对人T细胞增殖能力的影响。结果 MAGE－3基因在食管癌组织中的表达率为50％（15／30）；在30例相应癌旁正常组织中未见表达。成功获得了MAGE－1和MAGE-3可溶性蛋白；人T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE－1和MAGE－3蛋白产生应答。结论 MAGE－1和MAGE－3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

菌体内可溶性表达重组THANK蛋白的免疫调节活性分析

目的：构建含有人THANK基因的表达载体，诱导其在大肠杆菌中可溶性表达，并对表达的THANK蛋白的免疫调节性进行检测。方法：从含有全长，THANKcDNA的pMD18-THANK质粒中克隆THANK的胞外区片段，并将其亚克隆至原核表达载体pET-11a中，筛选阳性重组质粒pET-THANK,以IPTG诱导其可溶性表达，并以SDS－PAGE和Westen blot检测进行分析。表达的蛋白初步纯后，分析其对B、T细胞的免疫调节活性。结果：PCR扩增出了THANK胸包区cDNA片段，SDSPAGE和Western分析产重组的pET-THANK质粒可表达出THANK蛋白。可溶性THANK重组蛋白可共刺激B、T细胞的增生，并可诱导活化T细胞的凋亡。结论：本实验成功地将THANK胞外区片段在大肠杆菌中进行表达，表达的蛋白具有免疫调节活性。     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

粉尘螨第五组主要变应原（Der f5）的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第五组变应原（Dermatophagoides farinae,Derf5）基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法提取活粉尘螨总RNA,扩增Derf5片段,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a（＋）连接,转化入大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果,Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性。结果构建了重组质粒pMD18-Derf5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性。结论获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白,初步鉴定了该蛋白的免疫原性。     

带组氨酸标签的癌蛋白SET真核表达载体的构建及其表达

目的为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建了癌蛋白SET和His标签融合表达的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／SET—His。方法从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增SET—His基因并进行双酶切,序列纯化后定向克隆至pcDNA3．1／zeo（＋）载体,阳性克隆载体进行双酶切和测序鉴定．阳性克隆载体瞬时转染入L-02肝细胞,利用Western blotting检测SET—His融合蛋白的表达。结果利用RT—PCR从L-02细胞总RNA中成功克隆出SET基因,经双酶切和测序鉴定证实pcDNA3．1（＋）／SET—His真核表达载体构建成功。经Western blotting验证表明,SET—His融合蛋白在肝细胞中获得高效表达。结论该结果为研究SET蛋白相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机理奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的：构建人胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌型真核表达载体，并检测表达产物的生物活性。 方法：用RT-PCR法从人肝细胞克隆IGF-1基因，并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体，用脂质体法转染CHO细胞，将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞，用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况。 结果：成功扩增210 bp的IGF-1基因，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blotting检测具有7.7 kD特异性条带。骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加。 结论：成功构建分泌型IGF-1真核表达载体，其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用。     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性

将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。     

单纯疱疹病毒糖蛋白D与IL-2基因共表达质粒的构建及其免疫学鉴定

目的构建含单纯疱疹病毒I型糖蛋白D（gD）全长基因和人白细胞介素2（IL-2）共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2，并诱导其在抗原提呈细胞——树突状细胞（DCs）的表达。方法应用PCR方法分别扩增出HSV—l gD和IL-2基因，经PCR、双酶切及测序证实正确后分别插入真核表达载体IRES的上、下游。通过脂质体介导转染DCs，并进行免疫学鉴定。结果重组表达质粒IRES—gD—IL-2经PCR和酶切均出现相应长度的片段。经WesternBlot证实，HSV．1gD抗体可特异识别DCs内表达的gD蛋白。结论构建了gD与IL-2共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2，免疫印迹鉴定证实该表达产物具有免疫学活性。     

大鼠对氧磷酶1真核表达载体的构建及在体外的表达

目的构建大鼠对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)真核表达载体,并检测其在体外培养细胞中的表达及功能,为进一步探索运用其进行基因防治肺部感染奠定基础。方法利用RT-PCR扩增大鼠PON1编码区全长序列,克隆入pcDNA3.1( ),鉴定无误后,脂质体转染A549细胞及293细胞,Western印迹检测蛋白表达,并检测其芳香酯酶活性及对铜绿假单胞菌密度感知系统信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)的水解功能。结果分别从大鼠肝组织中扩增出1153bp片段,克隆入表达载体后进行酶切鉴定和测序结果正确。转染细胞后能够表达目的蛋白,该蛋白具有芳香酯酶和AHLs内酯酶活性。结论成功构建了含有大鼠PON1真核表达载体,质粒能够在真核细胞中表达,能够有效地水解铜绿假单胞菌密度感知系统信号分子。     

Prokaryotic expression and characterization of human AP DNA endonuclease

The expression of major human apurinic/apyrimidinic DNA endonuclease (APEX) from its cDNA in E. coli (DH5 alpha) was attempted in order to obtain a biologically active recombinant APEX. E. coli cells were transformed by a prokaryotic translation vector (pGEX-4T-3) harboring APEX cDNA. GST-APEX fusion protein with a molecular weight of 6.3 KDa was induced by IPTG (1.0 mM) treatment. Western blot immunodetection identified the induced protein as the GST-APEX fusion protein. The survival rate of E. coli cells (DH5 alpha) transformed with pGEX-4T-3-APEX increased when the cells were treated with N-diethyl-N-nitrosamine (DENA) or 3'-methyl-4-monomethylaminoazobenzene (3'-MeMAB), indicating that APEX expression had a protective effect on the cytotoxicity of these carcinogens. The fusion protein extracted from E. coli cells and purified by GSH-agarose gel affinity chromatography exhibited APEX activity. Treatment of thrombin to the GST-APEX fusion protein and affinity purification followed by Sephacryl S-100 gel filtration resulted in APEX peptide with MW 36 KDa, which exhibited AP DNA repair activity (8,7000 EU/mg protein). N-ethylmaleimide (0.1 mM) or AMP (0.98 mM) inhibited APEX activity by 50% and kinetic analysis indicated that the recombinant APEX (rAPEX) had a Km value of 0.022 microM (AP sites for AP DNA) and the Ki value was 0.48 mM for AMP. These results indicated that E. coli cells expressing biologically active GST-APEX were resistant to the cell damage caused by chemical carcinogens and that rAPEX purified from E. coli cells transformed with APEX cDNA-inserted translation vector was similar to native APEX in some properties.     

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。