自杀基因疗法联合化疗对癌胚抗原表达型肺肿瘤的杀伤作用

目的：探讨阳离子脂质体介导E.coli cd/HSV-1tk融合自杀基因联合长春瑞滨对癌胚抗原阳性肺癌的体内杀伤作用。方法：裸鼠皮下接种肺癌细胞SPCA－1后第5、9、13天,腹腔注射阳离子脂质体／pE-CEAcd-tk复合物,于第6－15天连续腹腔注射5－氟胞嘧碇＋丙氧鸟苷前体药物进行自杀基因治疗。于第5、13天给予长春瑞滨进行联合治疗。结果：阳离子脂质体介导融合自杀基因联合长春瑞滨使小鼠皮下的肿瘤结节的生长受到显著抑制,其平均瘤体体积显著小于单独自杀基因或化疗治疗组的平均瘤体体积（P＜0．01）。结论：阳离子脂质体介导E.coli cd/HSV-1tk融合基因联合长春瑞滨化疗在体内在有效抑制肺瘤的生长,为癌胚抗原阳性肺癌的治疗提供了1条新的途径。     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

放射诱导HSV—TK基因肺癌靶向性表达的研究

目的：构建由Egr-1启动子驱动HSV－TK基因表达的重组质粒，通过放射诱导调控HSV－TK基因的肿瘤靶向表达，以提高肺癌基因治疗的选择性和有效性。方法：利用基因重组方法构建tgEgr-HyTK表达载体；脂质体介导转染肺癌A549，SHG44细胞系，给以不同剂量γ射线照射，观察照射前后各时相点肺癌细胞HSV－TK表达情况；以及不同浓度前药GCV作用下肺癌细胞相对存活率的变化。结果：γ射线可诱导HSV－TK基因在被染肺癌细胞表达显著增强，呈剂量依赖性；照射后3h HSV－TK基因表达增强，于第8小时达峰值，第36小时恢复至照射前水平。经放射诱导后，tgEgr-HyTK转染肺癌细胞对GCV的敏感性明显升高（P＜0．05）；进一步发现，HSV－TK／GCV系统对放射线有较明显的增敏作用。放射和HSV－TK／GCV在肿瘤杀伤作用上存在明显协同效应。结论：利用Egr-1启动子调控HSV－TK基因的肿瘤靶向性表达，是一种高效，特异的肺癌基因治疗新策略。     

组织特异性CD/5-FC系统对大肠癌的原位基因治疗

  目的 探讨癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)组织特异性胞嘧啶脱氨基酶基因对不同分泌CEA大肠癌组织的靶向杀伤作用. 方法 脂质体法将CEA组织特异性逆转录病毒载体G1CEACDNa在PA317细胞中进行包装,大肠癌细胞LoVo和SW480分别接种到BALB/c裸鼠大腿皮下,成瘤2周后,瘤内多点注射法行原位基因转染,每天腹腔注射500mg/kg的5-FC(5-fluorocytosine),观察治疗效果. 结果 病毒滴度为5.6×106CFU/L.经多次注射法转染,目的基因在肿瘤组织中能有效表达,治疗21天后,基因治疗组有明显的抑瘤作用,但对LoVo细胞肿瘤的抑瘤作用明显大于对SW480细胞肿瘤. 结论 CEA组织特异性CD/5-FC系统对LoVo细胞肿瘤的抑瘤作用更明显.     

HSV-TK基因在膀胱癌的体内转移和GCV的治疗效果

目的：探讨HSV－TK基因在膀胱癌动物体内的合适转移途径，观察HSV－TK／GCV系统的体内治疗效果。方法：在T739同基因鼠膀胱癌皮下肿瘤模型中，以裸质粒DNA瘤内直接注射，脂质体包裹和逆转录病毒介导3种不同方法转移HyTK基因，观察GCV对膀胱癌的治疗效果。结果；脂质体复合物组及逆转录病毒组背部肿瘤生长减慢，抑瘤率分别为54％，68％。动物平均存活时间分别比对照组延长28．81％，44．16％。结论：脂质体，逆转录病毒介导的基因转移是膀胱癌基因治疗的有效手段。     

HSVTK/GCV自杀基因系统治疗乳腺癌的研究

 目的　探讨HSV TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782 / 5S 810 2体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法　采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2 ,得到带有HSV TK基因的MA782 / 5S 810 2 /TK细胞 ,并将其分别用于体外和体内实验。结果　载体HSV TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示 ,当MA782 / 5S 810 2 /TK细胞数占混合细胞 10 %时 ,低浓度 (10 μg/ml)的GCV就可将 5 0 %左右的肿瘤细胞杀死。体内实验结果显示GCV可明显抑制MA782 / 5S 810 2 /TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论　逆转录病毒可介导HSV TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2并获稳定表达 ,HSV TK/GCV自杀基因系统在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用 ,且存在明显的旁观者效应。     

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的：构建含胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）重组腺病毒（AdE1CMVCD），并鉴定；用自杀基因治疗系统（AdE1CMVCD/5-FC）对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法：体外实验：用不同稀释度的AdE1CMVCD)转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶（5-FC），用MTT法检测OD570nm值，按公式计算细胞生长抑制率；体内实验：建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型，瘤体内导入AdE1CMVCD，腹腔注射5-Fc，观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果：该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加，最大抑制率达61.29％，同时观察到了明显的旁杀伤作用；在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用，明显延长荷瘤小鼠生存期。结论：本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用，为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。     

逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究

目的 观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用，探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD tk细胞株。采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达。MTT法测定转基因组及末转基因组Raji细胞的存活率。结果 双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达，联合使用5-氟胞咳暖(5-FC)和无环鸟苷(QCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论 逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用。     

转录靶向性KDR启动子调控双自杀基因系统对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用

背景与目的 研究KDR启动子转录调控双自杀基因系统(CDglyTK)对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用.方法 应用分子生物学技术克隆KDR基因的启动子KDRP,构建KDR启动子调控的双自杀基因(CDglyTK)真核表达质粒pcDNA3-KDRp-CdglyTK.并将其导AL9981和人肝癌细胞HepG2中.给予不同的前药(GCV和/或5-FC)处理后,应用MTT法检测各组细胞的存活率.并应用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期和凋亡.结果 成功的克隆KDR启动子和构建pcDNA3-KDRp-CdglyTK质粒.pcDNA3-KDRp-CdglyTK转染后,L9981细胞中均可检测到CD和TK mRNA,而HepG2细胞中则无.联合应用5-FC+GCV处理对转双自杀基因细胞(L9981)的杀伤作用显著高于单独应用5-FC或GCV(P<0.05),且二者显示了良好的药物协同作用.结论 KDR基因启动子调控双自杀基因系统可以靶向性杀伤人肺癌细胞.     

放射诱导HSV-TK基因肺癌靶向性表达的研究

目的:构建由Egr-1启动子驱动HSV-TK基因表达的重组质粒,通过放射诱导调控HSV-TK基因的肿瘤靶向表达,以提高肺癌基因治疗的选择性和有效性。方法:利用基因重组方法构建tgEgr-HyTK表达载体;脂质体介导转染肺癌A549、SHG44细胞系,给以不同剂量γ射线照射,观察照射前后各时相点肺癌细胞HSV-TK表达情况;以及不同浓度前药GCV作用下肺癌细胞相对存活率的变化。结果:γ射线可诱导HSV-TK基因在被转染肺癌细胞表达显著增强,呈剂量依赖性;照射后3h HSV-TK基因表达增强,于第8小时达峰值,第36小时恢复至照射前水平。经放射诱导后,tgEgr-HyTK转染肺癌细胞对GCV的敏感性明显升高(P<0.05);进一步发现,HSV-TK/GCV系统对放射线有较明显的增敏作用。放射和HSV-TK/GCV在肿瘤杀伤作用上存在明显协同效应。结论:利用Egr-1启动子调控HSV-TK基因的肿瘤靶向性表达,是一种高效、特异的肺癌基因治疗新策略。     

双自杀基因对Raji淋巴瘤细胞杀伤的增强作用

目的 :观察反转录病毒介导的双自杀基因对 Raji淋巴瘤细胞的杀伤增强作用 ,探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 :通过脂质体将含有双自杀基因的反转录病毒载体 p WZL neo CDglytk导入病毒包装细胞 PA317,经 G4 18筛选后大量培养产病毒的阳性克隆 PA317/ CD+ tk细胞株 ,收集病毒上清 ,浓缩后转染 Raji淋巴瘤细胞 ,再次经 G4 18筛选 ,获得稳定表达双自杀基因的 Raji/ CD+ tk细胞株。用RT- PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物 5 -氟胞嘧啶 (5 - flourocytosine,5 - FC)和 /或无环鸟苷(Ganciciovir,GCV)后 ,MTT法测定细胞的存活率及 CDglytk双自杀基因对 Raji细胞的杀伤作用。结果 :双自杀基因在 Raji细胞中可稳定表达 ,联合使用 5 - FC和 GCV时 Raji细胞的存活率 (13.83% )明显低于单独使用 GCV (5 0 .6 5 % )或 5 - FC(5 7.6 8% )时 ,各组比差异具有显著性 (P<0 .0 1)。结论 :反转录病毒介导双自杀基因对 Raji淋巴瘤的杀伤作用明显增强     

缝隙连接蛋白43对双自杀基因系统旁观者效应的影响

Objective： To observe the influence of connexin 43 （Cx43） on the bystander effect induced by cytosine deaminase （CD） and herpes simplex virus thymidine kinase （HSV-tk） coexpression suicide genes system in human cholangiocarcinoma QBC939 cells and transplantation tumors in nude mice. Methods： In vitro, the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells were respectively treated with 5-fluorocytosine （5-Fc） and Ganciclovir （GCV）. The cytotoxic effect was evaluated by MTT method. In order to investigate the influence of Cx43 on the bystander effect, the size of transplantation tumors of the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells was measured before and after application of 5-Fc and GCV. Results： CD and tk genes were stably expressed in transfected QBC939 cells. The increased expression of Cx43 was determined by testing for the presence of Cx43 mRNA by RT-PCR and the presence of Cx43 protein by Western Blot in CD＋tk＋Cx＋ cells. The killing effect of 5-Fc and GCV on CD＋tk＋Cx＋ cells was more effective than that on CD＋tk＋ cells both in vitro and in vivo. Conclusion： Double suicide genes system CD/5-Fc＋tk/GCV could induce remarkable killing effect on cholangiocarcinoma cells in vitro and transplantation tumors in vivo. The cotransfection of Cx43 gene could enhance the bystander effect and hence the inhibition of carcinoma cells.     

逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞杀伤作用的实验研究

目的 :观察逆转录病毒介导的双自杀基因对K5 6 2细胞的杀伤作用 ,探讨慢性粒细胞白血病的基因治疗方法。方法 :通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,经G4 18筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317 CD +tk细胞株 ,收集病毒上清 ,浓缩后转染K5 6 2细胞 ,再次经G4 18筛选 ,获得稳定表达双自杀基因的K5 6 2 CD +tk细胞株。用RT PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物 5 氟胞嘧啶 (5 flourocytosine ,5 FC)和 或无环鸟苷 (Ganciciovir,GCV)后MTT法测定转基因组及未转基因组K5 6 2细胞的存活率。结果 :双自杀基因在K5 6 2细胞中可稳定表达 ,联合使用 5 FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用 5 FC或GCV。结论 :逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死K5 6 2细胞 ,双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建及体外效应研究

目的 构建高靶向性基因转移及基因表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞的体外杀伤作用。 方法 通过重组DNA技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。前者经IPTG诱导表达获取anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白作为非病毒转运载体,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及人肺癌细胞株A549,潮霉素筛选阳性细胞,扩大培养,分别命名为HepG2/tk、SMMC7721/tk及A549/tk,然后通过MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。 结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,表面TfR阳性且高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;表面TfR阳性但不分泌AFP的A549/tk细胞则对前药不敏感。 结论 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。     

AFP/ANGIO/TK靶向性融合基因治疗人原发性肝癌的效果观察

目的：研究pcDNA3／AFP／angio／tk靶向性融合基因系统对人原发性肝癌皮下移植瘤的治疗效果。方法：建立人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤模型。将荷瘤裸小鼠随机分为5组（每组6只）：肿瘤对照组；空质粒组；GCV组；pcDNA3／angio／tk组及pcDNA3／AFP／angio／tk组。瘤内分别注射不同的质粒，同时于裸鼠腹腔内注射GCV，在第二次瘤内给药后第2天及第三次瘤内给药后第15天，分别处死裸鼠进行检测（每次3只）病理学检查；原位末端标记（TUNEL）法检查细胞原位凋亡；透射电镜观察细胞超微结构变化。结果：病理学检查结果显示，prDNA3／AFP／angio／tk融合基因瘤内注射可明显抑制肿瘤生长。TUNEL法检测显示．pcDNA3／AFP／angio／tk组凋亡指数明显高于肿瘤对照组。透射电镜观察细胞超微结构变化，发现pcDNA3／AFP／angio／tk组有明显的细胞凋亡发生。结论：pcDNA3／AFP／angio／tk靶向性融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长，而且作用效果优于pcDNA3／angio／tk融合基因系统（P〈0.05）。     

Heat-directed suicide gene therapy mediated by heat shock protein promoter for gastric cancer

The prognosis of patients with metastatic gastric cancer, particularly peritoneal carcinomatosis, remains poor despite intensive interventions. Gene therapy and hyperthermia can be promising strategies for such advanced disease. The study was conducted to explore the possible effective therapeutic approach of suicide gene therapy with herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) in combination with hyperthermia for advanced gastric cancer. The heat shock protein (hsp) 70B gene promoter-oriented HSV-tk (HSP-tk)/ganciclovir (GCV) system directed by heat shock was developed. Hsp promoter activity under the control of heating was assessed by dual luciferase assay in gastric cancer cell lines and implanted tumors of nude mice. In vitro cytotoxic assay was performed using the HSP-tk/GCV delivered by the hemagglutinating virus of Japan (HVJ) liposome, with or without heating. Mice with subcutaneously xenografted tumors and peritoneal carcinomatosis were treated with hyperthermia and gene therapy using the HVJ-liposome-carrying HSP-tk. Assessment by luciferase assay demonstrated highly inducible and tumor-specific promoter activity in vitro and in vivo. Cytotoxic assays showed that cells transfected with HSP-tk became more sensitive to GCV with heating. A synergistic effect was also observed when treated with a non-heat-inducible cytomegalovirus (CMV) promoter-mediated HSV-tk/GCV and heating, indicating bystander killing. The HVJ-liposome-carrying HSP-tk/GCV combined with hyperthermia significantly inhibited the growth of subcutaneous tumors and prolonged survival of mice with peritoneal carcinomatosis. We conclude that the combination of suicide gene therapy with hyperthermia can provide a promising treatment modality for advanced gastric cancer.     

肺腺癌组织特异性自杀基因治疗实验研究

目的 探讨肺腺癌组织特异性自杀基因治疗的安全性及有效性。方法 采用病毒感染法，将癌胚抗原(CEA)基因启动子所驱动的CD基因的组织特异性逆转录病毒载体(G1CEACDNa)，导入分泌CEA的肺腺癌细胞系A549细胞．研究裸鼠体内抑瘤效果；应用重组逆转录病毒裸鼠体内治疗A549肿瘤，观察G1CEACDNa／5-氟胞嘧啶(5-FC)对A549细胞致瘤裸鼠的治疗作用及毒副反应。结果 (1)将转基因的A549细胞和未转基因的A549细胞接种至裸鼠皮下．两者成瘤性无明显差异；(2)在转基因细胞致瘤裸鼠实验中，5-FC对转CEA启动子调控自杀基因的肿瘤生长具有明显的抑制作用；(3)将G1CEACDNa重组逆转录病毒上清直接注射到裸鼠成瘤部位．然后腹腔内注射5-FC同样获得明显的抑瘤效果；(4)与直接注射5-FU相比，组织特异性自杀基因治疗对骨髓的抑制明显降低。结论 组织特异性自杀基因治疗可能成为肿瘤治疗个体化的重要方法之一。