杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达抗原的Western blot和MALDI-TOF/TOF分析

目的鉴定杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达抗原。方法培养杜氏利什曼原虫前鞭毛体并体外转化无鞭毛体,其总蛋白经2-DE电泳后以小鼠抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体血清进行Western blot,对前鞭毛体与无鞭毛体特异表达抗原蛋白进行MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定。重组表达无鞭毛体特异表达抗原编码基因,以Western blot法对重组蛋白进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体蛋白经2-DE电泳均可呈现680~742个蛋白点,Western blot及MALDI-TOF/TOF-MS分析甘油醛3-磷酸脱氢酶与延伸因子2为杜氏利什曼原虫前鞭毛体特异表达抗原,核苷二磷酸激酶为无鞭毛体特异表达抗原。重组核苷二磷酸激酶编码基因表达产物经Western blot证实为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。结论杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体抗原表达存在差异,核苷二磷酸激酶为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。     

不同种株利什曼原虫的比较蛋白质组学分析

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝胶,主要差异蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白均获近700个蛋白点,不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质2-D图谱中,14蛋白点呈恒定差异表达,从中鉴定出10个功能明确的蛋白质,分别具有下列生物功能:糖代谢与磷脂合成(烯醇酶、变旋酶、NADP依耐乙醇脱氢酶、乙醇胺磷酸胞苷酸转移酶),压力反应(细胞内过氧化物酶、锥虫还原蛋白过氧化物酶),细胞膜/细胞骨架(α-微管蛋白、β-微管蛋白),核酸代谢(琥珀酰辅酶A连接酶(GDP形成)、内源性RNA酶L-PSP(pb5)),细胞周期与增殖(延伸因子2)。结论不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质的表达存在不同,为理解不同种株利什曼原虫的毒力、免疫原性和代谢特征提供了新的视角。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋囟的基因克隆化与序列分析

目的　克隆墨西哥利什曼原虫(L.mer)WR972株的无鞭毛体蛋白(amastin)的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法　根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫VR972株的基因组DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2.1T载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果　从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA,以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCR2.1T载体片段进行的序列测定结果　表明,获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段,与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论　实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化,为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。     

不同种（株）利什曼原虫毒力相关基因的表达差异

目的 观察不同种（株）利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的毒力相关基因表达情况。 方法 制备杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫等5种7株利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的总RNA,采用半定量RT-PCR法,以α-微管蛋白基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）作为阳性对照,根据GenBank公布的GDP甘露糖焦磷酸酶基因（GDPMP）、A2抗原相关蛋白基因（A2rel）、脂磷酸多糖合成蛋白1基因（LPG1）、脂磷酸多糖合成蛋白2基因（LPG2）、动基体膜蛋白11基因（KMP-11）、胱氨酸蛋白酶C基因（CPC）、亲水性酰化表面蛋白B1基因（HASPB1）、胱氨酸蛋白酶2基因（CPB2）、胱氨酸蛋白酶B2.8基因（CPB2.8）和热激蛋白100基因（CLP b）等毒力相关基因的核苷酸序列,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析以上各基因在各种（株）前鞭毛体和无鞭毛体中的表达情况。 结果 各毒力基因在不同种（株）利什曼原虫的前鞭毛体和无鞭毛体中的表达明显不同,HASPB1基因在7个种（株）利什曼原虫的无鞭毛体和杜氏利什曼原虫前鞭毛体中均表达,GDPMP、LPG1、LPG2、CPB2.8、CPB2、A2rel和CLP基因分别在特定种（株）的前鞭毛体和/或无鞭毛体中表达,CPC基因仅在杜氏利什曼原虫SC10株和硕大利什曼原虫无鞭毛体内表达,KMP-11基因在7个种（株）利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体内均不表达。 结论 毒力相关基因的表达存在种特异性和期特异性。     

利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆4株利什曼原虫表面无鞭毛体蛋白（amastin）的编码基因,并进行序列分析。方法 根据锥虫（T.cruzi)与利什曼原虫亲缘关系相近的原则,首先以锥虫无鞭毛体蛋白的基因为参考。对GenBank中的dbFST数据库检索,获得硕大利什曼原虫（L.major)一段309核苷酸片段,根据其序列合成探针,对硕大利什曼原虫基因组DNA文库筛选,首先获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因,再以硕大利什曼原虫无鞭 毛体蛋白编码 基因序列为依据,合成特异性引物,以多聚酶链反应（PCR）扩增获得亚马逊利会曼原虫（L.ama.)、巴西利什曼原虫（L.bra.)和墨西哥利什曼原虫（L.mex.)的无鞭毛体蛋白基因。结果 克隆了4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码的基因。均为国际上首次克隆化基因,已被美国GenBank收录。结论 实现了4株利什曼原虫无鞭毛体 蛋白编码基因的克隆化。     

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的　构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)片段克隆,并进行测序及同源性分析。　方法　提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上,双脱氧链末端终止法测序。　结果　扩增出约 1000bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L.d.SC10和L.d.6分别为1027bp和1028bp。序列分析结果表明,L.d.SC10和L.d .6有一定差异。　结论　获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.SC10和L.d.6的前鞭体rDNAITS序列。     

杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果　以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (LeishmaniadonovaniLd) 1S株激活蛋白激酶C受体 (RACK ,receptorofactivatedpro teinCkinase)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗的研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法提取制备基因组DNA。以硕大利什曼原虫 (Leishmaniaamjor)的RACK基因的核苷酸序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物。以杜氏利什曼原虫的基因组DNA为模板 ,利用多聚酶链反应(PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫RACK的全长编码基因。结果　基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株RACK基因序列长度为 981bp ,开放读码框架由 831bp组成 ,编码产物为 2 76个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的RACK基因与来源于硕大利什曼原虫的RACK基因序列同源性达 98% (2 6 4 / 2 6 7)。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的RACK基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）真核表达重组质粒，并在NIH3T3细胞中进行表达。方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a—ctxA上切下ctxA基因，导入真核表达载体peDNA3．1（＋）．重组子pcDNA3．1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后，用脂质体法将重组质粒pcDNA3．1-ctxA转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法和Westernblot对peDNA3．1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果 重组质粒peD—NA3．1-ctxA成功转入NIH3T3细胞。利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达，用Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29ku的蛋白。结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒peDNA3．1-ctxA，并在NIH3T3细胞中表达出29ku的CTA蛋白。     

肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定

目的构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB—PEG10-EGFP，为制备转基因小鼠做准备。方法RT—PCR扩增PEG10基因cDNA序列，克隆入T载体进行酶切、测序鉴定，后将其定向克隆至真核表达载体pALB．EGFP中ALB的下游，构建转基因载体pALB—PEG10-EGFP；在Lipofectamine介导下转染L02细胞，经G418抗性筛选，挑选阳性克隆并扩大培养；采用RT—PCR、Westernb1ot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在L02细胞中的表达和细胞内定位。结果酶切和测序结果表明pALB—PEG10-EGFP构建成功；稳定转染后的L02表达有PEG10的mRNA及蛋白，且主要定位于胞浆。结论重组体pALB—PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础。     

HIF-1α质粒转染NIH3T3细胞的体外实验

目的探讨低氧诱导因子1(HIF-1)在NIH3T3细胞的体外表达.方法首先构建真核表达质粒,以脂质体为介导,体外转染细胞,经RT-PCR,Western blot,ELISA检测基因在mRNA、蛋白质等方面的表达.结果半定量RT-PCR证实在NIH3T3细胞表达外源基因,Western blot检测到外源HIF-1蛋白质表达,ELISA试验证明表达的基因产物具有生物活性.结论PcDNA3-HIF1真核表达质粒能够有效地在体外表达目的基因,为进一步的动物实验奠定了基础.     

人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。     

人瘦素的基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建重组人瘦素哺乳细胞表达载体并在COS-7细胞表达重组人瘦素。方法 提取脂肪细胞总RNA，用RT-PCR扩增人瘦素cDNA并克隆至载体pUCm-T，并对克隆基因进行DNA序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板，用特异引物扩增瘦素基因，经KpnI和BamH I酶切，插入相应酶切的哺乳细胞表达载体pcDNA3，构建重组哺乳细胞表达载体并转染COS-7细胞，RT-PCR和Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果 RT-PCR扩增的DNA片断和预期的人瘦素cDNA大小一致；序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道的人瘦素基因序列一致；经RT-PCR和Western印迹鉴定，转染的COS-7细胞可表达、分泌人瘦素。结论 构建了人瘦素的哺乳动物细胞表达载体，并成功地在COS-7细胞中获得重组人瘦素的分泌表达。     

重组大鼠GATA4-pEGFP基因在骨髓间充质干细胞的表达及意义

目的 体外获得表达重组大鼠GATA4-pEGFP基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步研究后者在心肌梗死治疗中的作用奠定基础.方法 提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得GATA4基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后GATA4-pEGFP质粒,采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs.将重组质粒GATA4-pEGFP以Lipo2000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周,Western blot和荧光检测重组质粒在MSCs中的表达情况.结果 成功构建重组大鼠GATA4-pEGFP真核表达载体并转染入MSCs中,Western blot和荧光检测证实GATA4-pEGFP基因在MSCs中呈阳性表达.结论 成功建立表达大鼠GATA4-pEGFP基因的MSCs,此为利用组织工程学方法治疗心肌梗死的研究奠定了基础.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。