睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的:构建人胰腺核糖核酸酶(hpRNase)原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础.方法:针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX-HTb;在大肠杆菌B121中经IPTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性.结果:经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆入pPROEX-HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20 kD的蛋白产物,经Western blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA.结论:成功构建hpR-Nase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础.     

增殖诱导配体及其在肿瘤发生发展中的作用

增殖诱导配体（APRIL）是近年来发现的肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员。通过对APRIL的基因蛋白结构、组织表达、信号传导通路的研究，发现它在多种肿瘤细胞内表达，并对肿瘤细胞的增殖和抗凋亡发挥重要作用。抑制APRIL与其受体结合、阻断其信号传导通路可明显抑制肿瘤细胞的增殖从而为肿瘤的治疗提供新途径。     

增殖诱导配体及其在肿瘤发生发展中的作用

增殖诱导配体(APRIL)是近年来发现的肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员。通过对APRIL的基因蛋白结构、组织表达、信号传导通路的研究,发现它在多种肿瘤细胞内表达,并对肿瘤细胞的增殖和抗凋亡发挥重要作用。抑制APRIL与其受体结合、阻断其信号传导通路可明显抑制肿瘤细胞的增殖从而为肿瘤的治疗提供新途径。     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.     

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的: 克隆并表达canstatin基因，初步检测其抑制血管生成的活性。方法: 采用RTPCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA，克隆入pMD18T载体中，并测序鉴定。在QIA表达系统中表达，Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果: 经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致，重组进pQE30表达载体，IPTG诱导表达并纯化成功，表达产物能明显抑制血管生成。结论: 成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验中具有明显抑制血管生成活性     

人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

目的克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总菌体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1600,Western blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

可溶性血管内皮生长因子受体2片段的克隆、表达及其在肿瘤血管形成中的作用

目的 对可溶性血管内皮生长因子受体2(VFGFR2)片段阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)与相应受体结合抑制血管形成的作用进行体内外实验研究。方法 应用RT-PCR技术,从胎鼠肝脏扩增Flk-1／KDR片段,重组于逆转录病毒载体PLXSN和表达载体pFT-28b( ),并行表达、纯化和鉴定。以原代培养的小鼠内皮细胞,观察可溶性受体蛋白对内皮细胞生长的影响。以脂质体法转染肿瘤细胞系S180和B16,观察基因转染后的体内生物学特点。结果 在受精后第9,11天的胎鼠肝组织中分离出1000bp大小的可溶性VEGFR2片段,连接TA克隆载体,经测序此片段为VEGFR2胞外段部分序列。将可溶性VEGFR2片段克隆入表达载体pET-28b( ),体外实验显示,可溶性受体蛋白能有效抑制内皮细胞的生长和增殖。将可溶性VEGFR2片段克隆入逆转录病毒载体PLXSN并成功转染肿瘤细胞系S180和B16,体内实验显示,转基因细胞系的瘤重减轻,体积明显缩小,且其血管密度明显降低,而Flkl蛋白表达明显增高。结论 可溶性VEGFR2片段是一种有效的抑制血管形成的生物工程产品,有望作为抗血管形成基因治疗的靶点。     

人存活素cDNA的克隆和原核表达

目的克隆人存活素(survivin)编码区基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR法得到人存活素编码区cDNA,克隆入原核表达载体pRSETB,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)PlyS,0.1mMβ-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。结果获得人存活素编码区cDNA,构建原核表达载体pRSETB-survivin,转化菌株可表达人存活素蛋白,蛋白分子量约为20KD,蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%。Western blot表明融合蛋白能与人存活素多克隆抗体特异性结合。结论获得人存活素编码区cDNA,并在大肠杆菌中表达了人存活素-组氨酸融合蛋白。     

重组血管抑制剂CHM-I对骨肉瘤的治疗作用

目的：观察重组人软骨调节素（chondromodulin，CHM）蛋白对骨肿瘤的治疗作用。方法：利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM—I基因片段，并将其克隆到原核表达载体pET28a，在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白，将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养，观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响；将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤，观察其对肿瘤形成的影响。结果：获得纯化的重组人软骨调节素蛋白，该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响；重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。结论：重组人软骨调节索蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长，具有良好的临床应用价值。     

肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备

目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1( ),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。     

羧肽酶A1及其活性中心基因的表达及活性分析

目的:克隆羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体进行诱导表达,分析表达产物活性.方法:RT-PCR扩增CPA1全酶及活性中心基因,测序分析后将目的基因克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实插入方向正确后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的基因后SDS-PAGE电泳分析.目的蛋白经变性、复性、纯化后MTT法和集落形成试验鉴定其活性.结果:获得了人CPA1全酶及活性中心基因,目的基因诱导表达后约66 kD及46 kD处可见新生蛋白带;活性分析显示CPA1全酶和活性中心蛋白都具有一定的催化水解活性,但后者对肿瘤细胞的杀伤效果较弱.结论:能成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因,获得了二者的原核表达产物,体外具有一定活性.可望以人羧肽酶A1全酶及其活性中心基因为新起点,继续完善优化羧肽酶A1系统,为抗体靶向治疗前列腺癌的临床应用奠定基础.     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

人吲哚胺2,3-双加氧酶多克隆抗体的制备

背景与目的:吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是一种哺乳动物细胞质中的血红素蛋白,是催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢的限速酶.它的表达不仅能抑制病原微生物的生长,还能抑制T细胞的应答,从而介导肿瘤免疫耐受.本研究的目的是表达和纯化His-hIDO融合蛋白,制备兔抗人IDO多克隆抗体,并用此抗体检测IDO在肿瘤细胞中的表达.方法:将编码人IDO全长cDNA克隆入pET30a( ),测序鉴定表达载体pET30a( )-hIDO,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白His-hIDO;用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人IDO多克隆抗体;用Western blot检测该多克隆抗体与重组蛋白His-hIDO的反应性,并用该抗体分析表皮癌细胞A431和肝癌细胞HepG2经IFN-γ诱导前后的IDO表达情况.结果:His-hIDO融合蛋白可与抗His多克隆抗体特异性结合;兔抗人IDO多克隆抗体的效价高,特异性好,能检测肿瘤细胞经IFN-γ诱导后的IDO的表达.结论:兔抗人IDO多克隆抗体能够有效地识别体外表达的IDO蛋白,为研究IDO在肿瘤免疫耐受中的作用提供有力工具.     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

ULBP3胞外段基因的克隆与表达

目的 为了研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能，首先需构建、表达ULBP3胞外段重组蛋白。方法 用RT-PCR方法从人结肠癌组织中钓取ULBP3胞外段基因，构建pET32a原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，Western blot鉴定。结果 经测序证实，所获得的cDNA克隆为ULBP3胞外段基因，其序列与genebank中已经发表的序列完全一致，pET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL21后，经筛选获得的阳性重组菌稳定表达ULBP3胞外段重组蛋白。结论 成功表达了ULBP3胞外段重组蛋白，可用于进一步研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能。     

重组血管抑制剂CHM-Ⅰ对骨肉瘤的治疗作用

目的观察重组人软骨调节素(chondromodulin,CHM)蛋白对骨肿瘤的治疗作用.方法利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-Ⅰ基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白,将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养,观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响;将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤,观察其对肿瘤形成的影响.结果获得纯化的重组人软骨调节素蛋白,该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响;重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长.结论重组人软骨调节素蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长,具有良好的临床应用价值.