人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白，为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物，通过反转录PCR技术，从一例胰腺切除患者的组织标本中，扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列，亚克隆入表达载体pPROEX—HTb；在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达，并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化；通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定，hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体；IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物，经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应；经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体，并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白，为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。

Construction of prokaryotic expression plasmid with human pancreatic ribonuclease gene and protein expression and identification