全反视黄酸对豚鼠视网膜色素上皮细胞分2泌TGF-β2及细胞内第二信使IP3和cAMP的影响

目的观察全反视黄酸（ATRA）对培养的豚鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖以及分泌转化生长因子p2（TGF—β2）的影响，并观察细胞内第二信使cAMP和IP3的含量变化。方法培养原代豚鼠RPE细胞，传2代后用于实验。实验分3组进行。第1组用不同浓度ATRA（5×10^-6、10×10^6、40×10^-6mol／L）作用于豚鼠RPE细胞，24h后用MTT法检测细胞增殖情况。第2组加入10×10^-6mol／L的ATRA．分别于2、4、6、8、16h后收集培养液，用ELISA方法检测RPE细胞TGF—β2的分泌量。第3组以10×10^-6mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞．分别于0min、5min、30min、2h、6h后收集细胞裂解液。行放射免疫和ELISA方法检测细胞内cAMP和IP3的含量变化。每组均以等量溶剂DMSO作为对照。对不同浓度ATRA组间MTT结果行方差分析，其余实验组与对照组间比较行配对t检验。结果5×10^-6、10×100、40×100mol／LATRA作用RPE细胞24h后，DD值分别为0．099±0．008、0．117±0．008、0．087±0．011。与对照组（0．103±0．017）比较，40×10^-6mol／LATRA作用时OD值显著降低，差异有统计学意2（P〈0．05），其他浓度组与对照组相比差异无统计学意义（p〉0．05）。10×10^-6／mol／L的ATRA作用RPE细胞后，TGF—β2的分泌量在作用2、4、6h时较对照组明显升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）．8h时无明显变化，16h时降低（P〈O．05）。10×10^-4mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞后，IP3的含量在各时间点均较对照组显著下降，且随时间的延长下降越明显；cAMP的含量只有在作用30min和2h时升高．其他时间变化不明显。结论浓度为40×10^-6mol／L的ATRA对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用。10×10^-6mol／L的ATRA作用RPE细胞后．TGF-β2的分泌量在6h内增加，之后随时间延长而降低。ATRA对RPE细胞的作用可能与IP3的下降有关。     

雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用

背景性激素在干眼症的发病过程中起着重要的作用,尤其是对泪腺的功能起到非常重要的调控作用,但其对泪腺上皮细胞凋亡作用的机制尚不完全明确。目的探讨雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导的兔泪腺上皮细胞的凋亡作用。方法分离2～3月龄雄性普通级新西兰兔的泪腺组织,用组织块培养法体外培养兔泪腺上皮细胞,用细胞角蛋白（CK）抗体对培养的细胞进行免疫细胞化学鉴定。取对数生长期的细胞,以5×10^-5个／ml接种于96孔板培养44h后,培养基中分别加入1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol／L的雌二醇或丙酸睾酮培养24h,再加入1×10^-4 mol／L H2O2培养1h诱导细胞凋亡,仅用H2O2作用的细胞作为凋亡对照组,常规培养的细胞作为空白对照组。MTT比色法检测各组细胞570nm处泪腺上皮细胞活性的吸光度（A570）值,流式细胞仪Annexin V／PI双染法检测各组细胞的凋亡情况。结果培养的细胞呈不规则多边形,其中80％以上的细胞对CK呈阳性反应。MTT比色法检测表明,与空白对照组比较,凋亡对照组、不同浓度雌二醇组和丙酸睾酮组的A。值均明显降低,差异均有统计学意义（P〈0．01）,1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7mol／L雌二醇组和1×10^-6mol／L丙酸睾酮组的A570值均明显高于凋亡对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。与相应浓度丙酸睾酮组相比,雌二醇组A570值均明显增高,差异均有统计学意义（P〈0．01）。与凋亡对照组比较,丙酸睾酮组和雌二醇组早期及晚期细胞凋亡率均明显下降,差异均有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）;与丙酸睾酮组相比,雌二醇组早期及晚期的细胞凋亡率明显下降,差异均有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）。结论雌二醇及丙酸睾酮可抑制H2O2诱导的泪腺上皮细胞的凋亡,雌二醇的抑制作用强于丙酸睾酮。雌二醇对泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用呈一定的剂量依赖性。     

内皮素-1对体外培养人小梁网细胞纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察内皮素-1（ET-1）对人小梁网细胞（TMCs）细胞外基质纤维连接蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ）的影响。方法取死亡24h内尸眼小梁网组织,行TMCs原代和传代培养,并用FN、层黏连蛋白（LN）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和Ⅷ因子相关抗原（FⅧRAg）鉴定为人TMCs后,取传3代的人TMCs,给予不同浓度ET-1（10^-9、10^-8、10^-7mol／L）孵育72h后,免疫荧光和Western blot观察ET-1对TMCs中FN、COLⅠ表达的影响;然后取传3代的人TMCs,分别给予10^-7mol／L ET-1、10^-7mol／L ET-1＋10^-7mol／L ETA受体拈抗剂、10^-mol／L ET-1＋10^7mol／L ETB受体拈抗剂后孵育72h,Western blot观察ET受体拮抗剂对FN、COL Ⅰ表达的影响。结果研究受到伦理委员会的批准,取材前征得供体家属的知情同意。培养的细胞形态多样,含少许色素颗粒,FN、LN、NSE染色均呈阳性反应,FⅧRAg呈阴性反应。人TMCs与10^-9～10^-7mol／L ET-1共孵育后FN表达上调（F=18．41,P〈0．05）;与10^-8mol／L、10^-7mol／L ET-1共孵育后COLⅠ表达上调（F=39．81,P〈0．05）,并呈浓度依赖性,10^-7mol／L时作用最明显;给予ETA受体拮抗剂后,与ET-1组相比,FN、COLⅠ的表达均降低（qFN=7．213,P〈0．05;qCOLⅠ=6．187,P〈0．05）,但给予ETB受体拮抗剂后,FN、COLⅠ的表达均无明显变化。结论ET-1能够促进体外培养的人TMCs中FN、COLⅠ的表达,其机制可能是通过激动ETA受体而非ETB受体发挥作用的。     

全反式维甲酸诱导的Cx43基因在RB细胞中的过表达及其对RB生长的抑制作用

背景诱导细胞间隙连接蛋白（＆）基因在瘤细胞中过表达是全反式维甲酸（ATRA）抑制肿瘤细胞生长的重要机制。我们先前的研究已证实,ATRA抑制视网膜母细胞瘤（RB）细胞增生、分化作用的机制与诱导Cx43过表达有关,但药物作用位点及其对在体肿瘤组织生长的影响尚未明确。目的研究ATRA对RB细胞中Cx43基因及其蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法用无水乙醇将ATRA溶解并配制成浓度为1×10^-2mol／L的溶液,使用前再用细胞培养液配制成不同浓度ATRA液。用含体积分数10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液常规培养人RB细胞株HXO—RB44,将1×10^5-×10“和1×10^-2mol／L的ATRA分别加至培养基中,分别于添加后2、4、6d采集细胞,分别采用Westernblot法和逆转录PCR法检测细胞中Cx43蛋白及mRNA的表达变化。选取15只BALB／c裸鼠,将RB细胞悬液1恤l（含5×10^5个细胞）进行裸鼠右眼前房注射,建立裸鼠眼前房RB模型。将造模成功的11只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和1X10。mol／LATRA组,阴性对照组和1×10^-5mol／LATRA组裸鼠分别行0．5％无水乙醇的生理盐水或1×10^-5mol／LATRA前房注射,每3天1次,共注射3周,裂隙灯显微镜下观察各组裸鼠肿瘤生长情况;实验结束时摘除实验眼,用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查。结果Westernblot法检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43蛋白表达量（Acx43／AGPDH）均逐渐增加,总体比较差异有统计学意义（F时间=71．31,P=0．00;F分组7．66,P=0．00）;药物作用后2d1×10^-5mol／LATRA组、作用后4d1×10^-6mol／LATRA组、作用后6d1×10^-7mol／LATRA组Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义（t=3．34,P〈0．叭;t=2．33,P〈0．05;t=3．12,P〈0．01）。逆转录PCR检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43 m     

抗青光眼术后滤过泡瘢痕化组织人Tenon囊成纤维细胞的生长特性

背景 抗青光眼滤过术后瘢痕组织中的主要细胞成分是人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）,探讨滤过泡瘢痕组织中HTFs的生长特性可为抗青光眼滤过术后预防瘢痕形成的研究提供实验基础. 目的 研究抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化组织中HTFs的体外生长特性. 方法 收集因抗青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化行二次手术的患者8例8眼的Tenon囊组织（4 mm＆#215;5 mm）,同期以同样的取材方法收集行斜视矫正术患者8例8眼的正常Tenon囊组织.采用组织块贴壁法将Tenon囊组织进行原代培养,用鼠抗人波形蛋白细胞免疫荧光法鉴定培养的HTFs,并用巢式PCR法检测培养的HTFs中是否受到支原体的污染.分别于第0、4、7、11、14天以发光法细胞活力检测HTFs,并绘制各组细胞的生长曲线,计算细胞群体倍增时间（PDT）.比较瘢痕组和正常组HTFs形态学和PDT的差异;将瘢痕组第5代与第15代HTFs的形态及PDT进行比较,评价细胞传代生长特性的稳定性. 结果 HTFs原代培养1～2周达到融合,呈长梭形,形态符合HTFs,传代细胞4～6 d达到融合.瘢痕组与正常组HTFs的生长特性相近,对鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性反应,PCR检测未见支原体反应条带.瘢痕组和正常组HTFs的PDT分别为（20.54±3.51）h和（18.86±2.91）h,差异无统计学意义（t=0.634,P=0.561）.细胞培养后第4、7、11和14天,瘢痕组HTFs的细胞数与正常组比较差异均无统计学意义（t=2.663,P=0.081;t=0.194,P=0.863;t=3.338,P=0.053;t=0.627,P=0.565）,2个组的HTFs随培养时间的延长显示出一致的增生曲线.瘢痕组第5代和第15代细胞PDT分别为（20.54±3.51）h及（22.84±4.15）h,差异无统计学意义（t=0.733,P=0.505）;第5代与第15代间细胞生长曲线可见其增生能力均稳定,两代间HTFs在各时间点的细胞数差异均无统计学意义（t=1.528,P=0.235;t=0.269,P=0.786;t=1.954,P=0.139;t=0.730,P=0.506）.结论 抗青光眼术后滤过泡瘢痕化患者的HTFs体外培养生长状态良好,增生能力稳定,是进行青光眼术后滤过区抗纤维化研究的良好靶细胞.     

辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

背景有多种因素参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病,其中视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化应激损伤与AMD的发病密切相关。实验和临床研究表明,辅酶Q10是一种强抗氧化剂,探讨其对人RPE细胞的氧化应激损伤是否有保护作用对于AMD的防治有重要的临床意义。目的探讨辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法体外培养人RPE细胞,分为正常对照组（单纯培养基培养）、不同浓度（0．01、1、100μmol／L）辅酶Q10预处理组和单纯叔丁基过氧化氢（TBHP）处理组,其中各浓度辅酶Q10预处理组以辅酶Q10预处理后暴露于TBHP,光学显微镜下观察各组RPE细胞的形态;用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组RPE细胞活性的变化;AnnexinV—FITC／PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;TBARS法检测细胞的脂质过氧化水平;用DCFH—DA荧光法检测细胞内活性氧簇（ROS）水平;实时定量PCR法检测RPE细胞中促凋亡基因FasmRNA的表达;Westernblot法检测细胞中Fas蛋白的表达。结果单纯TBHP处理组RPE细胞贴壁数量较正常对照组明显减少,而0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组贴壁细胞数较单纯TBHP处理组增加,高浓度辅酶Q10预处理组细胞形态的改善和细胞存活的数目更接近正常对照组。与单纯TBHP处理组比较,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组RPE细胞吸光度（A450）值明显增高（0．52±0．10VS．0．25±0．03、0．59±0．06VS．0．25±0．03）,差异均有统计学意义（P=0．041、0．002）;RPE细胞的凋亡率明显下降[（72．1±6．6）％VS．（91．7±2．3）％、（69．0±4．4）％VS．（91．7±2．3）％],差异均有统计学意义（P=0．032、0．004）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组的细胞脂质过氧化水平依次降低,与单纯TBHP处理组比较差异均有统计学意义（P=0．047、0．030、0．015）,与单纯TBHP组相比,0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平逐渐下降,I;xmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平明显低于单纯TBHP处理组（5．25±0．90 vs11．39±2．30、7．91±0．80VS．11．39±2．30）,差异均有统计学意义（P=0．028、0．007）;与单纯TBHP处理组相比,辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量均有不同程度的下降,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量的差异均有统计学意义（P=0．049、0．008）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中Fas蛋白表达量均明显下降,差异均有统计学意义（P=0．001、0．000、0．000）。结论辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞具有保护作用,其作用在一定范围内呈浓度依赖性,这种保护作用可能与减少细胞的氧化应激损伤和抑制细胞凋亡有关。     

外源性视黄酸对人巩膜成纤维细胞MMP-2及TIMP-2 mRNA水平的影响

目的 研究外源性视黄酸（RA）对人巩膜成纤维细胞（HSF）生长的调控,以及对基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶2组织抑制剂（TIMP-2）mRNA水平的影响.方法 体外培养HSF,取第5～7代细胞,经10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L浓度的RA作用6 d后,进行细胞计数,观察RA对HSF生长的调控情况;用Real-time PCR检测RA作用后HSF中MMP-2、TIMP-2的mRNA水平.对不同浓度组问比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验.结果 RA作用HSF 6 d后,浓度≥10^-9 mol/L RA组对细胞的生长抑制作用差异均有统计学意义（P〈0.05）,随着RA浓度增高,细胞数量逐渐减少,抑制作用呈剂量效应.RA作用6 d后,RA≥10^-8 mol/L时,HSF中MMP-2 mRNA水平有升高趋势,但各组差异无统计学意义（P〉0.05）;RA≥10^-9 mol/L时,TIMP-2 mRNA水平下降（P〈0.05）.结论 RA能够抑制HSF的生长,并可能通过调控TIMP-2的mRNA水平,使巩膜主动重塑.     

羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制

背景研究表明,羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡,但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性,并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库,采用组织块培养法培养和传代HTFs,采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板,分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1,终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h,用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组,药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白,采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形,波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后,随着药物质量浓度的增加,对HTFs增生的抑制率增加,差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34,P=0．00;VP-16：F=62．60,P=0．00;HCPT＋VP-16：F=46．77,P=0．00）,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L,HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399,表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％,差异有统计学意义（F=18．23,P〈0．01）,其中HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs凋亡率较空白对照组明显升高,差异均有统计学意义（q’=15．67、16．32、26．88,P〈0．01）。Westernblot法检测结果表明,与空白对照组相比,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中活化型easpase．3、bax、p-JNK表达的灰度值明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,且HCPT＋VP-16处理组HTFs中上述各因子表达的灰度值较HCPT处理组、VP-16处理组明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,而easpase-3、JNK、Akt的表达无明显变化。与空白对照组比较,bcl-2、p-Akt在HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中的表达量明显下降,HCPT＋VP-16处理组较HCPT处理组、VP-16处理组的表达量明显减少,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论单独使用HCPT、VP-16均能诱导体外培养的HTFs凋亡,其作用均呈剂量依赖性,HCPT与VP-16联合应用有强协同作用。HTFs中p-JNK、bax的表达上调和p-Akt、bcl-2表达的下调参与联合用药引起的协同效应。     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

视黄酸对豚鼠离焦性近视眼视网膜色素上皮通透性的调控

背景视网膜视黄酸在离焦性近视形成中起重要作用,但目前尚不清楚其如何通过视网膜色素上皮（RPE）屏障向脉络膜传递近视信号。目的研究全反式视黄酸（atRA）对离焦性近视眼RPE屏障功能的影响。方法21日龄清洁级三色豚鼠30只,用随机数字表法分为正常对照组和离焦组,一6D凹透镜缝合于离焦组豚鼠左眼15d以制备离焦性近视模型,每天光照与黑暗周期为12h／12h。用角膜曲率计测量各组豚鼠的角膜曲率半径,行复方托吡卡胺滴眼液扩瞳检影验光以测量豚鼠眼球屈光度,应用A型超声法测量各组豚鼠的眼轴长度。于造模15d时处死动物并分离视网膜,体外培养RPE细胞并传代,将第3代RPE细胞用于实验,制备视网膜铺片,接种于Millcell—PET微孔滤膜插入式培养池,分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9mol／LatRA培养RPE细胞24h,以加入等体积atRA溶剂的培养孔作为阴性对照,以完全培养基加MTT溶液的无细胞孔作为空白对照。采用MTT比色法检测各组RPE细胞的存活率,用CN10一EVOM2型电阻测量仪测定单层细胞跨上皮电阻（TER）,计算RPE细胞的TER值,采用FM1-43型荧光染色技术检测得出RPE细胞FM1-43阳性荧光染色的相对强度值,评价RPE细胞膜泡运输变化。结果豚鼠模型眼屈光度为（-2．20±O．95）D,对照组为（＋1．15±0．30）D,差异有统计学意义（t=14．57,P〈0．01）;豚鼠模型眼的眼轴长度为（8．24±0．09）mm,明显长于对照组的（7．81±0．05）mm,差异有统计学意义（t=17．20,P〈0．01）。原代培养豚鼠近视眼的RPE细胞,取第3代细胞用于实验。RPE细胞接种于Millcell培养池1周后细胞长满滤膜,呈单层生长。加入atRA干预24h,RPE细胞的存活率随药物浓度的升高而逐渐降低,1×10^-9 mol／LatRA组RPE细胞存活率为93．3％,1×10-8mol／LatRA组为88．2％,1×10-6mol／LatRA组和1×10-7mol／LatRA组的RPE细胞大量死亡。不同浓度atRA组RPE细胞的TER值和RPE细胞FMl_43阳性荧光染色的相对强度值的总体比较差异均有统计学意义（F：43．89,P=0．00;F=26．13,P=0．00）,其中1×10-mo[／LatRA组RPE细胞的TER值为（107．32±9．58）Ω）／cm2,荧光染色强度为55．29±9．79,均明显高于1×10-、1×10-、1×10-mol／LatRA组,差异均有统计学意义（P〈0．05）,FMl_43荧光染色部位主要在RPE细胞的细胞膜和细胞质。结论AtRA能够通过增加豚鼠近视眼RPE的紧密连接功能及膜泡运输改变RPE细胞的屏障功能。     

羟基喜树碱对人眼Tenon蒺s囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱（HCPT）对人眼Tenon＇s囊成纤维细胞（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTFs）的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法：取本院眼库新鲜眼球（〈6h）的Tenon＇s囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养;流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C（MMC）对HTFs细胞周期的影响;台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起;RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。结果：HTFs体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT（0,0.25,1,4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;不同浓度MMC（0,0.025,0.1,0.4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。4mg/LHCPT,0.4mg/LMMC作用HTFs24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期;HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关;HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7mRNA的表达阻断TGF-茁信号通路实现的。     

转化生长因子β及其受体在翼状胬肉中基因表达的定量检测

目的：定量检测转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）及其受体在翼状胬肉和正常球结膜组织中的表达水平,探讨其在翼状胬肉病变发生发展过程中的作用。方法：随机选取翼状胬肉患者30例,手术切除翼状胬肉组织,并留取患眼角膜上缘上方的正常球结膜组织作为自身对照,实时荧光定量PCR技术分析翼状胬肉和正常球结膜组织中TGF-β1、TGF-β2及其I型和Ⅱ型受体相对于内参照基因18S的相对mRNA含量。结果：TGF-β1在正常球结膜和翼状胬肉组织中平均表达水平分别为4．26×10^-7±1．45×10^-7和10．67×10^-7±7．47×10^-7,TGF-β2在正常球结膜和翼状胬肉组织中表达水平分别为1．08×10^-10±0．68×10^-10和8．23×10^-11±6．63×10^-11。TGF-βI型受体在正常球结膜和胬肉组织中平均表达水平分别为0．003015±0．0036和0．000379±0．000281,TGF-βⅡ型受体在正常球结膜和胬肉组织中表达水平分别为5．33×10^-5±5．05×10^-5和1．002×10^-5±9．04×10^-6。TGF-β1在胬肉组织中表达水平比正常结膜中表达水平升高倍数为2．9±2．8,差异有统计学意义（P〈0．01）。TGF-β2在胬肉组织中表达水平比正常结膜中表达水平升高倍数为7．5±1．4,差异有统计学意义（P〈0．01）。TGF-βI型受体在胬肉组织中表达水平比正常球结膜中明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05）。TGF-βⅡ型受体在胬肉组织中表达水平比正常球结膜中表达水平明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：TGF-β1和TGF-β2在胬肉组织中表达水平均高于正常球结膜组织。TGF-β1在正常球结膜和胬肉组织中表达水平均远高于相应组织中的TGF-β2表达,但是TGF-β2在胬肉中表达水平升高变化幅度高于TGF-β1。TGF-βI型和Ⅱ型受体在胬肉组织中表达水平均低于正常球结膜组织。TGF-I型受体在正常球结膜和胬肉组织中表达水平均高干相应组织中的TGF-βⅡ型受体表达,提示胬肉组织中I型、Ⅱ型受体表达的降低可能导致TGF-β分泌的增加,从而导致翼状胬肉病变的发生发展,提示转化生长因子-β及其受体在翼状胬肉病变发生发展中可能起着重要的作用。     

内皮素-1体外对人小梁细胞骨架肌动蛋白的影响

目的：观察内皮素-1（endothelin-1,ET—1）对人眼小梁细胞细胞骨架肌动蛋白的影响。方法：培养3代人眼小梁细胞,随机分为4组：对照组（0mol／LET-1）;ET-1低剂量组（10^-9mol／LET—1）;ET-1中剂量组（10^-8mol／LET—1）;ET-1高剂量组（10^-7mol／LET—1）,各组细胞分别处理72h后,应用Western—blot方法检测小梁细胞骨架肌动蛋白（F—aetin）的表达,并用FITC—phalloidin荧光探针观察肌动蛋白在细胞内的分布。结果：ET—1作用后人小梁细胞肌动蛋白表达明显增高,在10^-9～10^-7mol／L浓度范围内呈剂量依耐性,荧光探针示ET-1处理组小梁细胞肌动蛋白应力纤维和周边肌动蛋白明显增多浓集,细胞微丝附着与胞膜,细胞间连接及细胞贴壁部位连接明显增多。结论：ET—1能促进小梁细胞肌动蛋白表达,参与了小梁细胞骨架的重构。