小檗碱与梓醇及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运子4蛋白及C-Cb1相关蛋白表达的影响

目的观察梓醇与小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗及这一过程中葡萄糖转运子4(Glut4)和C-Cb1相关蛋白(CAP)表达的影响。方法采用高糖联合高胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗(IR),分别给予小檗碱、梓醇、小檗碱 梓醇、盐酸罗格列酮进行干预,以葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗量,以Western Blotting法检测Glut4和CAP蛋白的表达。结果与模型组相比,小檗碱能增加培养液中葡萄糖的消耗,但对Glut4蛋白的表达无影响;梓醇、小檗碱 梓醇均能显著增加培养液中葡萄糖的消耗,并使细胞中Glut4蛋白的表达增强,且小檗碱 梓醇组的效应优于梓醇组及小檗碱组;与模型组相比,小檗碱与梓醇及其配伍对CAP的表达没有显著性影响。结论小檗碱、梓醇及其配伍能改善IR 3T3-L1脂肪细胞的胰岛素活性,其作用机制与罗格列酮不同。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

TNF-α对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的影响及罗格列酮的干预作用

目的观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的影响及罗格列酮的干预作用。方法采用不同浓度TNF-α（5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）处理3T3-L1脂肪细胞48h、采用20μg/ml TNF-α处理不同时间（6h、12h、24h、48h）及罗格列酮（10μmol/ml）预处理6h的3T3-L1脂肪细胞与20μg/mlTNF-α作用48h;以2-DG摄入法检测细胞对葡萄糖的摄取率。结果与对照组比较,5μg/L、10μg/L和20μg/LTNF-α作用各组分别使葡萄糖摄取率减少了25%（P〈0.01）、43%（P〈0.01）、58%（P〈0.01）;20μg/L TNF-α处理3T3-L1脂肪细胞6h、12h、24h、48h使葡萄糖的摄取率分别减少10%（P〈0.05）、28%（P〈0.01）、40%（P〈0.01）、57%（P〈0.01）,罗格列酮预处理能使20μg/ml TNF-α组脂肪细胞对葡萄糖的摄取率增加37%（P〈0.01）。结论TNF-α以浓度和剂量依赖方式导致脂肪细胞胰岛素抵抗;罗格列酮能明显改善此作用。     

不同浓度葡萄糖对3T3-L1细胞分化及insig-1和insig-2 mRNA表达的影响

目的:观察不同浓度葡萄糖对小鼠前脂肪细胞(3T3-L1细胞)分化及insig-1和insig-2mRNA基因表达的影响,探讨insig基因在脂肪细胞分化与代谢中的作用.方法:将3T3-L1细胞分别在高葡萄糖浓度(25 mol/L G.S)、低葡萄糖浓度(5.5 mol/L G.S)和甘露醇(19.5 mol/L甘露醇 5.5 mol/L G.S)中诱导分化,利用油红"O"染色检测脂肪细胞分化,RT-PCR和原位杂交法检测insig-1和insig-2 mRNA、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(AP2)mRNA表达的动态变化.结果:随着3T3-L1细胞的分化,insig-1和insig-2 mRNA和AP2 mRNA表达逐渐上调,低糖诱导组及甘露醇对照组细胞分化程度显著低于高糖诱导组,但两组insig-1和insig-2 mRNA的表达较高糖诱导组明显上调(P＜0.05),而AP2mRNA表达则下调;低糖诱导组与甘露醇对照组细胞分化程度及各基因表达无明显差别.结论:葡萄糖浓度可影响脂肪细胞分化;低糖时脂肪细胞分化及脂质沉积相对受抑制,可能与insig基因表达上调有关.     

罗格列酮改善胰岛素抵抗细胞摄取葡萄糖的途径研究

目的 探讨地塞米松和胰岛素联合作用诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗后,罗格列酮改善抗性细胞摄取葡萄糖的途径.方法 在地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗后,加入10-5 mol/L罗格列酮,作用48 h改善细胞抗性,提取细胞总RNA和总蛋白,Western blot显示葡萄糖转运子(GLUT4)丰度,RT-PCR检测GLUT4和信号分子c-Cbl 相关蛋白(c-Cbl associated protein,CAP)的基因表达.结果 ①罗格列酮显著增加了细胞GLUT4的转录水平和翻译水平,其表达丰度介于正常组与抵抗组之间.②罗格列酮提高了CAP基因水平,增强经CAP途径调节的GLUT4的转位.结论 罗格列酮可能通过启动其下游基因GLUT4和CAP基因表达,增加GLUT4的数目,并激活CAP信号途径,提高GLUT4向细胞膜的转位,改善细胞对葡萄糖的摄取,从而改善胰岛素抵抗.     

疏肝理气、化湿活血法对胰岛素抵抗3T3-L1细胞FGF-21水平及其受体表达的影响

目的观察疏肝理气、化湿活血法对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞FGF-21水平及其受体FGFR1及FGFR2表达的影响。方法采用1μmol/L地塞米松诱导脂肪细胞胰岛素抵抗。将细胞分为正常对照组、模型对照组、吡格列酮组及中药高、低剂量组。加入含药血清处理后,分别于24h、48h采用葡萄糖氧化酶法检测各孔细胞上清液葡萄糖浓度,采用酶联免疫吸附法检测上清液中FGF-21浓度,培养后48h采用荧光定量PCR法检测细胞FGFR1及FGFR2基因表达水平。结果中药高、低剂量及吡格列酮均可增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量,同时降低其FGF-21水平,与相同时间段模型对照组比较均具有统计学意义(P<0.01);吡格列酮可上调胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的FGFR1、FGFR2 m RNA表达量(与模型对照组比较P<0.05或P<0.01),中药仅高剂量组可上调其FGFR2 m RNA相对表达量(与模型对照组比较P<0.05)。结论疏肝理气、化湿活血法可改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗水平,其机制可能与FGF信号通路有关。     

氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的机制研究

目的探讨氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的主要作用机制。方法以地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,建立胰岛素抵抗细胞模型,根据细胞模型添加干预药物的不同分为模型对照组（不添加任何药物）、氯沙坦组（分别给予1、10、100μmol/L氯沙坦干预48 h）和wortmannin＋氯沙坦组,wortmannin＋氯沙坦组以100 nmol/L的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性抑制剂wortmannin预处理20 min后再加入100μmol/L氯沙坦干预48 h。观察脂肪细胞体积的变化,采用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖的浓度,采用Western blotting分析脂肪细胞中PI3K和胰岛素受体底物1（IRS-1）的表达以及IRS-1丝氨酸磷酸化水平。结果与模型对照组比较,氯沙坦组脂肪细胞体积明显缩小（P〈0.01）,细胞培养上清液中葡萄糖的浓度显著降低（P〈0.01）,PI3K和IRS-1表达明显上升（P〈0.01）,IRS-1丝氨酸磷酸化水平显著下降（P〈0.01）但可被wortmannin阻断。结论氯沙坦可使3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的细胞体积缩小,并增加细胞对葡萄糖的利用,其机制可能与PI3K信号通路有关。     

血清淀粉样蛋白A在3T3-L1脂肪细胞的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的 了解血清淀粉样蛋白A(SAA)在3T3-L1脂肪细胞的表达情况及其与胰岛素抵抗的关系.方法 用3种不同浓度的地塞米松(10、100、1000nmol/L)建立3种不同程度的脂肪细胞胰岛素抵抗模型(分别称为模型组1、模型组2、模型组3),同时设立空白对照组.采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄入情况.以葡萄糖摄入减少的百分比反映胰岛素抵抗程度;RT-PCR技术检测各组SAAmRNA的表达,ELISA检测SAA蛋白的表达.结果 各组基础状态下葡萄糖的摄取率无明显差异(P>0.05);胰岛素刺激后模型组1、模型组2、模型组3的葡萄糖摄取率分别比对照组减少了15%(P<0.05)、40%(P<0.01)、55%(P<0.01);SAAmRNA的表达量分别是对照组的2.5(P<0.01)、3.33(p<0.01)、4.08倍(P<0.01);SAA蛋白表达量分别是对照组的2.05(P<0.05)、3.13(P<0.01)、4.23倍(P<0.01);相关分析显示3T3-L1脂肪细胞SAA mRNA的表达量(r=0.773,P<0.01)和蛋白表达量(r=0.832,P<0.01)与胰岛素抵抗程度均呈正相关.结论 采用地塞米松干预3T3-L1脂肪细胞可成功建立胰岛素抵抗模型;脂源性炎症因子SAA与胰岛素抵抗密切相关,它可能是胰岛素抵抗的一个标记物.     

地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的 应用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法. 方法 3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,将其与10 nmol/L和100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松共孵育,100 nmol/L胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运.以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量,观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响,鉴定IR模型. 结果 地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运,抑制作用呈剂量依赖性,其中1 μmol/L地塞米松的抑制率分别为80%及75%(P＜0.05). 结论 地塞米松可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR,这种细胞模型简便、可靠.     

GLP-1通过下调ATGL表达参与3T3-L1脂肪细胞脂质代谢

目的探讨胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对胰岛素抵抗模型3T3-L1 脂肪细胞的影响及其可能的机制。方法分别使用
GLP-1、胰岛素、胰岛素加GLP-1 干预胰岛素抵抗模型3T3-L1 脂肪细胞,Western blotting 检测脂肪组织甘油三酯水解酶
（ATGL）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、Akt1、Akt2 及其磷酸化蛋白表达量;免疫荧光法检测GLP-1 干预后脂肪细胞的成脂情
况。结果胰岛素刺激下3T3-L1脂肪细胞Akt1、Akt2活化不明显。GLP-1刺激下3T3-L1脂肪细胞磷酸化Akt1、Akt2表达明显
增加,同时促进GLUT4向细胞膜上转移,并抑制ATGL蛋白的表达。在胰岛素的协同作用下这一现象更加明显。结论GLP-1
通过降低脂肪细胞ATGL蛋白表达参与脂质代谢,同时增强脂肪细胞GLUT4的膜转移,促进葡萄糖吸收,改善胰岛素抵抗。
     

蒙药“通拉嘎-5”对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其机制研究

目的探讨"通拉嘎-5"对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其作用机制。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞后,"通拉嘎-5"作用于3T3-L1脂肪细胞24 h,用3H标记的2-脱氧-葡萄糖([3H]2-DG)示踪检测胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的情况;"通拉嘎-5"作用3T3-L1脂肪细胞48 h后,用Real-time PCR检测PPARγ和LXRα的基因表达,用Western blot检测PPARγ和LXRα的蛋白表达。结果 "通拉嘎-5"能促进胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取(比阴性对照组高1.915倍,P<0.05);能明显上调3T3-L1脂肪细胞和LXRα基因(比阴性对照组高2.895倍,P<0.01)和蛋白(比阴性对照组高1.977倍,P<0.01)表达;而对PPARγ基因和蛋白表达无明显的影响。结论 "通拉嘎-5"可能通过提高3T3-L1脂肪细胞LXRα的基因和蛋白表达,促进胰岛素介导的葡萄糖摄取功能,改善胰岛素抵抗,可能为"通拉嘎-5"治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用机制之一。     

罗格列酮抗氧化应激效应影响3T3-L1细胞内脏脂肪素表达

目的:研究罗格列酮对3T3-L1细胞内脏脂肪素表达的影响及其机制。方法:体外培养并诱导分化3T3-L1细胞,加入葡萄糖激酶制作氧化应激模型,并用不同浓度和不同作用时间罗格列酮干预,观察脂肪因子表达的变化。结果:内脏脂肪素的表达随着葡萄糖激酶氧化应激的浓度增高而递减,具有剂量依赖效应(P<0.05);内脏脂肪素的表达随着罗格列酮干预浓度增加而增加(P<0.05),随着罗格列酮作用时间的延长,内脏脂肪素的表达经历了先下降后上升的过程,且罗格列酮对于内脏脂肪素表达的影响与氧化应激状态的改变平行。结论:罗格列酮可以通过抗氧化应激作用调节内脏脂肪素的表达,可能在罗格列酮改善肥胖相关的2型糖尿病胰岛素抵抗中起到重要作用。     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

氯化钴诱导低氧对3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白表达的影响

目的研究体外模拟低氧对小鼠3T3-L1脂肪细胞脂连蛋白（ADPN）表达的影响。方法体外培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,将其诱导分化成为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞分化程度和脂质积聚情况。氯化钴（CoCl2）化学模拟脂肪细胞低氧环境,采用实时PCR（Real-TimePCR）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和ADPNmRNA的表达,蛋白质印迹法（Westernblotting）检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达;酶联免疫吸附测定（ELISA）分析细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平。结果在CoCl,诱导3T3-L1脂肪细胞低氧的条件下,细胞内HIF-1αmRNA和蛋白的表达水平均显著上调;细胞内ADPNmRNA表达和细胞培养上清液中ADPN蛋白的分泌水平均显著下降;HIF-1αmRNA与ADPNmRNA的表达水平呈显著负相关（r=-0．854,P〈0．001）。结论CoCl2诱导低氧能够下调3T3-L1脂肪细胞ADPN的表达,该作用可能与脂肪细胞代谢功能障碍和胰岛素抵抗有关。     

Effects of fatty acid regulation on visfatin gene expression in adipocytes

Background The levels of long-term elevated serum or intracellular free fatty acid （FFA） induce insulin resistance associated with central obesity. The insulin-mimetic protein visfatin is preferentially produced by visceral adipose tissues and has been implicated in obesity and insulin resistance. To identify that FFA is capable of inducing insulin resistance and to clarify the role of FFA on visfatin, we examined the effect of monounsaturated FFA oleate （C 18： 1） and saturated FFA palmitate （C 16：0） on glucose transport and visfatin gene expression in cultured 3T3-L1 adipocytes or preadipocytes. Methods FFA-free DMEM/F12, 0.125 mmol/L, 0.5 mmol/1 and 1.0 mmol/L oleate or palmitate was added to cultured 3T3-L1 adipocytes or preadipocytes and incubated overnight. Glucose transport was assessed as 3H- 2-deoxy-glucose uptake. Total RNA was extracted and subjected to RT-PCR for the measurement of visfatin mRNA levels. Statistical comparisons between control group and other groups were performed with the two-tailed paired t test, and one-way ANOVA was used to compare the mean values among the groups. Results Insulin increased specific membrane glucose transport in 3T3-L1 preadipocytes. Upregulation was evident from 15 minutes to 1 hour exposure to insulin. However, after 6-hour exposure to insulin, there was a downregulation in the response to insulin. Dose response studies demonstrated that 2-deoxy glucose transport was increased by 336% at 50 nmol/L insulin （P〈0.01）, and reached a maximal effect at 100 nmol/L insulin （P〈0.01）. Oleate and palmitate treatment did not influence basal glucose transport （without insulin stimulation）, whereas insulin-stimulated glucose transport was inhibited after overnight oleate and palmitate treatment in preadipocytes and adipocytes. In 3T3-L1 preadipocytes, insulin resistance could be achieved at 0.125 mmol/L oleate or palmitate （P〈0.05, respectively）, and the inhibition was dose dependent. In adipocytes, the inhibition was noted at 0.5 mmol/L oleate or 1.0 mmol/L palmitate. Visfatin mRNA expression increased during differentiation more than 1.5-fold. Bovine serum albumin （BSA） did not influence visfatin mRNA expression compared with the control group. Dose-response studies demonstrated that addition of 0.125 mmol/L oleate and palmitate to 3T3-L1 adipocytes decreased visfatin mRNA expression significantly （78%, 77%, respectively, relative to untreated control, P〈0.05）, and further to 65% （relative to untreated control, P〈0.05） and 55% （relative to untreated control, P〈0.01） at 1.0 mmol/L FFA. Furthermore, the suppression on preadipocytes was similar to that of adipocytes, which reached a maximal reduction of 44% （oleate, P〈0.05） and 47% （palmitate, P〈0.05） at 1.0 mmol/L FFA. Conclusions Oleic acid and palmitic acid may induce insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes and preadipocytes. Downregulation of visfatin mRNA may contribute to impair insulin sensitivity caused by oleate and palmitate.     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。