聚氧乙烯辛烷基酚制备去细胞神经移植体

目的采用聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)去除周围神经中的雪旺细胞和髓鞘,制取天然神经细胞外基质,构建组织工程化神经移植体。方法健康新西兰大耳白兔30只,分别自梨状肌下缘水平以远切取10 mm双侧坐骨神经60根,随机分为A(12 h组)、B(24 h组)、C(48 h组)、D(96 h组)、E(1 w组)用于化学萃取,F(新鲜神经)为对照组。5组神经Triton X-100萃取时间分别为12 h、24 h、48 h、96 h、1 w。在新鲜神经和萃取后的神经中段分别切取1段2 mm神经,10%甲醛固定,常规石蜡包埋、纵形切片,行HE染色、磷钨酸苏木素(PTAH)染色、阿尔辛蓝(Alcianblue)染色、层黏连蛋白(Laminin)免疫组化染色。在光镜下对各组神经进行观察。结果光镜下对各组神经进行观察,新鲜神经可见雪旺细胞分布均匀,髓鞘、基底膜排列整齐。随着萃取时间的延长雪旺细胞、髓鞘逐渐减少,髓鞘与基底膜的界限不清,至96 h时神经雪旺细胞、髓鞘消失,纵切片上基底膜呈栅栏样排列,膜与膜之间为中空结构的基底膜管,萃取时间至1 w时,基底膜仍清晰,但由胶原纤维构成的管状结构排列疏散,不规则,部分有断裂。扫描电镜下观察,随着萃取时间延长,神经内的轴突、髓鞘逐渐减少,萃取时间至96 h时神经内的轴突、髓鞘已被完全去除,可见由胶原纤维构成的立体管状结构,胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征,管内并可见膜样结构。萃取时间为1 w时,由胶原纤维构成的立体管状结构与96 h的标本相似,但结构较之稍散乱,形成的管腔不规则。A～F组切片单位面积Lamiain平均灰度分别为:140.1±3.41;142.1±3.14;142.1±3.14;140.4±4.03;141.7±2.62;142.7±7.24,各组间无显著性差异(P=0.751)。结论用Triton X-100化学萃取方法是制备组织工程化神经移植体的有效方法。萃取人类长段粗大神经时,可适当延长萃取时间,不致破坏基底膜的主要成分层黏连蛋白。     

猪主动脉瓣去细胞基质的制备

目的完全去除猪主动脉瓣细胞,取得良好的去细胞支架材料。方法用5 g/L胰酶对标本中的某些基质和细胞加以消化后,再应用不同去垢剂（十二烷基硫酸钠、脱氧胆脂酸钠、Triton X-100）加以洗脱,结合溶液渗透压改变等去除猪主动脉瓣细胞;标本进行大体、光镜、电镜观察和热皱缩温度的检测。结果胆脂酸钠无法完全脱除猪主动脉瓣细胞,十二烷基硫酸钠和曲拉通均可完全去除猪主动脉瓣细胞,Triton X-100组的主动脉瓣胶原纤维和弹性纤维得以较好保持。结论Triton X-100可以成功脱除猪主动脉瓣细胞,为组织工程瓣膜的研究提供材料。     

大鼠脊髓T9全横断后损伤区域超微结构观察

目的 观察大鼠脊髓全横断损伤后神经细胞及髓鞘超微结构变化特征.方法 将36只成年Wistar大鼠随机分为正常对照组及脊髓(T9)完全横断伤后8 h组、24 h组、48 h组、1周组、3周组,每组6只.分别在各时间点灌注固定后取材,制备常规HE染色切片及电镜标本,对各组动物脊髓内神经细胞及髓鞘形态变化进行观察和分析.结果 脊髓损伤后神经元和神经胶质细胞呈不同形式的死亡,髓鞘肿胀,紊乱.术后8 h,损伤中心以细胞坏死为主,损伤周围出现凋亡细胞,以少突胶质细胞为主.随着时间的延长灰质和白质内凋亡细胞增多.损伤后期胶质细胞增生明显.结论 脊髓损伤后神经细胞和髓鞘超微结构随时间变化呈多样性,凋亡是脊髓继发性损伤中细胞死亡的重要形式.     

蛋白多糖在脱细胞猪肺动脉带瓣管道中抗钙化的作用

目的:证实去除细胞外基质蛋白多糖对提高脱细胞猪肺动脉带瓣管道抗钙化性能的作用,为研制组织工程化肺动脉带瓣管道做准备。方法:实验分为3组,即A组:为新鲜猪肺动脉带瓣管道组织,B组:用胰蛋白酶+Triton X-100处理的脱细胞猪肺动脉带瓣管道组织和C组:在B组处理的基础上再经透明质酸酶消化,去除细胞外蛋白多糖基质成分的猪肺动脉带瓣管道组织,每组4份(n=4)。方法:实验室:将3组样本分别进行HE染色后,用光镜和扫描电镜观察肺动脉管壁及瓣膜组织的变化。采用盐酸胍抽提结合阿利新蓝染色法测定蛋白多糖的含量。同时将3组样本包埋于大鼠皮下,于6周后取出标本进行Van Kosaa银染色法(钙盐染色)和原子吸收分光光度计法分别定性、定量分析组织的钙化程度。结果:光镜和电镜检查结果显示,猪肺动脉管壁和瓣膜组织的细胞可以较完整的去除,纤维网架结构可以完整保持。蛋白多糖含量的测定显示,与A、B组相比,C组细胞外基质蛋白多糖的含量显著下降(P<0.05)。大鼠皮下包埋实验显示,与A、B两组相比,C组的钙化反应更少,管壁组织钙的含量显著下降(P<0.05)。结论:采用胰蛋白酶+Triton X-100脱细胞方法可以达到去除细胞的目的。通过大鼠皮下包埋实验证明,采用透明质酸酶消化减少细胞外基质蛋白多糖的含量可以进一步减少脱细胞组织的钙化反应,为组织工程肺动脉带瓣管道的构建提供较为理想的脱细胞基质材料。     

老年大鼠脑白质损害在学习记忆降低中的意义

目的 探讨老化时轴突及髓鞘结构和成分变化在学习记忆功能改变中的意义.方法 使用穿梭箱、电镜和免疫组织化学技术,观察老年大鼠学习、记忆维持功能、髓鞘和轴突的超微结构改变,以及髓鞘碱性蛋白表达变化.结果 在训练第1天至第6天,老年大鼠主动逃避反应率（AAR）、总逃避反应率（GAR）较青年组显著减慢（P＜0.01）,逃避潜伏时（LER）较青年组延长（P＜0.01）,训练第6天GAR青年组达到89.0%,老年组为40.5%,LER青年组为3.16 s,老年组为6.10 s.在记忆功能维持上,训练后第5天和第10天,老年组大鼠AAR、GAR很快降低,LER明显升高（P＜0.01）.老年大鼠髓鞘异常为轴突周围间隙扩大,髓鞘致密层分离,部分板层结构破坏,髓鞘内形成大泡,轴突直径增加,轴突内含有吞噬小泡、致密颗粒和巨大线粒体,少突胶质细胞电子密度增加.老年大鼠髓鞘碱性蛋白（MBP）表达下降.结论 老年大鼠学习及记忆维持能力降低,老化可以导致轴突及髓鞘的结构变化,MBP表达降低,髓鞘结构和成分改变可能参与老化时学习和记忆损害.     

乳鼠雪旺细胞与自体颅骨组织块体外联合培养对颅骨组织生长的影响

目的探讨乳鼠雪旺细胞与自体颅骨组织块体外联合培养对颅骨组织生长的影响。方法培养和纯化雪旺细胞,将27块颅骨组织块分为A组(颅骨组织块单独培养)、B组(雪旺细胞和颅骨组织快直接接触培养组)和C组(雪旺细胞和颅骨组织块通过钛板间接接触培养组),每组9块,分别培养1 w、2 w、3 w。采用免疫组化法测定颅骨组织骨钙素(BGP)和骨桥蛋白(OPN)水平,测定培养液中骨碱性磷酸酶(BALP)活性含量。结果三组之间BGP水平和BALP活性含量差异有统计学意义(F=18. 912,P0. 001)。两两比较:B组各时间点BGP水平和BALP活性含量明显高于A组和C组(P0. 05),C组各时间点BGP水平和BALP活性含量明显高于A组(P0. 05);同组不同时间点BGP水平和BALP活性含量比较差异有统计学意义(P0. 05),随着时间延长BGP水平和BALP活性含量升高。经方差分析,三组之间OPN水平差异无统计学意义(F=1. 510,P0. 05)。不同时间点和不同组间两两比较差异均无统计学意义(P0. 05)。结论雪旺细胞可以促进颅骨组织的生长,雪旺细胞与颅骨组织直接接触对颅骨组织生长的促进作用更显著。     

不同时间点枸杞多糖灌胃处理对大鼠双侧海绵体神经缺损后腓肠神经移植的修复效应

目的观察在不同的时间点枸杞多糖(LBP)灌胃处理对双侧海绵体神经缺损腓肠神经移植后大鼠海绵体神经损伤的修复效果。方法 28只SD雄性大鼠随机分成4组:双侧海绵体神经切断后自体腓肠神经移植术后第1天开始LBP灌胃持续2 w组(A组),术后第1周开始LBP灌胃持续2 w组(B组),术后第1天开始生理盐水灌胃持续2 w组(C组),假手术组(仅分离但不损伤双侧海绵体神经)。3个月后,通过电刺激观察海绵体内压的变化来反映其勃起功能,取海绵体神经干甲苯胺蓝染色,观察有髓鞘轴突数目,阴茎海绵体组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)染色,检测海绵体内的一氧化氮合酶(NOS)阳性神经纤维数目。结果 3个月后,A组阴茎海绵体内压显著低于假手术组(P0.05),但显著高于C组(P0.05),B组阴茎海绵体内压显著低于假手术组(P0.05),显著高于C组(P0.05),而A组显著低于B组(P0.05)。A组轴突数显著高于C组(P0.05),但显著低于假手术组(P0.05),B组轴突数显著低于假手术组(P0.05),显著高于C组(P0.05),而A组显著低于B组(P0.05)。A组NOS阳性神经纤维数显著低于假手术组(P0.05),但显著高于C组(P0.05),B组NOS阳性神经纤维数显著低于假手术组(P0.05),显著高于C组(P0.05),而A组显著低于B组(P0.05)。结论 LBP灌胃对腓肠神经移植替代受损的海绵体神经的再生有促进作用,而在腓肠神经移植术后1 w应用比术后第1天应用对神经再生的效果更佳。     

Nogo-A及其在缺血性脑血管病中的作用

髓鞘相关抑制因子是中枢神经系统轴突再生的主要障碍,其中Nogo-A是少突胶质细胞合成的一种重要抑制因子.在缺血性脑血管病动物模型中,Nogo-A的表达水平发生明显变化;针对Nogo-A及其下游通路的治疗措施,能有效促进轴突再生和改善神经结构可塑性,促进功能恢复,为人类脑血管病治疗模式的发展提供可靠的理论基础.     

制备犬胸主动脉脱细胞血管支架的新方法

目的 研究制备犬胸主动脉脱细胞血管支架的新方法,制备出理想的犬胸主动脉脱细胞基质,从而为构建组织工程血管提供支架材料.方法 在无菌条件下从成年比格犬体内取出胸主动脉血管段（28根）,随机分成4组：A组血管段设为正常对照组;B组血管段置于-70℃的冰箱和4℃冰箱内反复冻融2次;C组血管段在0.1％的SDS溶液中持续震荡1d;D组血管段经历反复冻融后置于1％ Triton X-100的PBS溶液和1μmol/L PMSF的混合液中常温下震荡2d,于0.01％的SDS溶液中持续震荡1d,最后加入核酸酶Dnase 0.2 mg/L和Rnase0.02 mg/L消化24h.四组血管段经历不同的过程后,全部从大体形态、光镜、电子显微镜观察、力学性能测试、免疫组化等角度进行检测并做统计学分析.结果 0.1％ SDS法虽能完全脱除细胞,但制备的脱细胞基质弹力纤维排列紊乱,部分发生断裂,且不能保持良好的形状和张力强度,管腔有不同程度的塌陷;反复冻融＋1％ Triton X-100＋PMSF＋0.01％ SDS法不仅能完全脱除细胞,保持基质纤维的正常排列结构,而且制备的脱细胞基质能保持良好的形状和力学性能,管腔无塌陷.结论 联合应用反复冻融、Triton X-100、PMSF和SDS的方法能够将犬胸主动脉的细胞成分除去,是一种制备脱细胞血管支架的有效方法.     

糖尿病外周神经病变的发病机理研究进展

糖尿病外周神经病变为糖尿病常见并发症,其确切发病机制尚未明,总体归为神经损害性因素增强与保护性因素减弱两方面,可能为综合性的结果。近期该病发病机理的研究进展涉及到缺血、缺氧性损伤,高血糖-山梨醇积聚-肌醇减少,非酶性糖基化异常,雪旺细胞与轴突联系异常,神经轴突转运及生长因子异常及痛性神经病变发病机制等方面。     

钙通道阻滞剂对大鼠周围神经损伤后组织形态学的影响

目的 研究钙通道阻滞剂对大鼠周围神经损伤后组织形态学的影响.方法 选用清洁级雄性SD大鼠60只.制作大鼠右侧坐骨神经损伤模型,并行神经外膜端端吻合术,术后随机分为实验组和对照组,每组30只.实验组腹腔注射盐酸维拉帕米注射液4 mg·kg-1·d-1,对照组腹腔注射等量生理盐水4mg·kg-1·d-1.分别于术后12 w取材,进行血管灌注、I型胶原纤维免疫组织化学染色、透射电镜观察.并对实验资料进行图像分析和统计学处理.结果 实验组较对照组神经损伤处血管数目及交通支多,I型胶原纤维增生少,髓鞘板层厚且走行规则.结论 钙通道阻滞剂可以明显抑制神经瘢痕形成,改善神经损伤局部微循环,增加毛细血管长入,促进神经再生.     

糖尿病皮肤小纤维神经病变30例临床分析

糖尿病(DM)神经病变的主要病理改变神经纤维消失包括有髓无髓轴突消失,轴突萎缩,轴突再生,但再生纤维活性下降,神经纤维脱髓鞘和髓鞘再生。DM神经病变的主要临床表现有轻微瘙痒、麻刺感、烧灼感、固定性或弥漫性疼痛、肌肉痉挛、皮肤高度敏感肌肉消瘦等等。国内罕见DM皮肤小纤维神经病变研究,本研究旨在通过皮肤神经活检对DM皮肤小纤维神经病变进行研究。     

子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H+L表达的影响

目的探讨子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）、神经微丝H＋L（neurofilament—H＋L，NF-H＋L）表达的影响。方法建立SD大鼠宫内缺氧模型，免疫组化检测子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H＋L表达并行图像分析；电镜下观察子代大鼠脑内髓鞘、轴突、微血管的超微譬构。结果宫内缺氧的主效应可使子代大鼠老年期脑白质的MBP、NF-H＋L表达减少（均P〈0.05），MBP与NF-H＋L呈高度正相关（R2=0．64，P〈0．01）。电镜观察，与空白对照组相比，宫内缺氧组子代大鼠老年期脑内可见较多的髓鞘脱失、轴突受损、微血管病变。结论宫内缺氧可影响子代大鼠老年期脑白质MBP、NF—H＋L表达，出现髓鞘脱失、轴突受损。     

曲拉通X-100对制备脱细胞真皮基质影响的实验研究

目的探讨由曲拉通X-100制备脱细胞真皮基质(ADM)的最佳浓度及作用时间,为表皮细胞种植于ADM形成组织工程化口腔黏膜提供实验依据。方法取大鼠2cm×2cm大小的皮肤56块,置于0.25% Dispase试剂中4C下孵育48小时,轻轻去掉表皮,随机分成7组,分别浸入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%、3%、10%的曲拉通X-100中作用36～80小时。取标本制作组织切片,HE染色,大体、光镜观察。结果光镜检查结果显示,制备出的脱细胞真皮基质主要由胶原纤维网架构成;曲拉通X-100浓度较低(0.1%～0.5%)时,皮肤脱净细胞成分的时间随浓度升高而逐渐缩短,各浓度间有明显差异(P均<0.01),而当浓度>0.5%时,皮肤脱净细胞时间与浓度无关,组间无显著差异(P>0.05)。结论曲拉通X-100制备大鼠ADM的最佳浓度为0.5%,时间为(45±2.82)小时。     

不同种属颅外段面神经结构的比较

目的通过比较鼠、兔、犬、人颅外段的面神经主干及各分支的解剖学和组织学结构,总结＂一干多支＂周围神经的特点。方法在外科显微镜下解剖、分离出鼠、兔、犬、人的颅外段面神经主干及颞支、颧支、颊支、下颌缘支、颈支5个分支,各20根全面神经,分别进行石蜡切片HE染色,半薄切片甲苯胺蓝染色,超薄切片电镜观察,运用图像分析软件Image.pro.plus.5.0,分别记录各种属面神经主干及各分支的神经直径、神经分束、轴突直径、髓鞘厚度等结构特点。结果面神经直径鼠〈兔〈人〈犬;面神经分束,鼠2～4束,兔2～6束,人5～9束,犬各分支均只有1束;轴突直径鼠〈兔〈犬〈人;髓鞘厚度鼠〈兔〈犬〈人。结论不同种属的＂一干多支＂神经具有不同的特点。     

维拉帕米对体外培养神经瘢痕成纤维细胞形态学的影响

目的 观察钙通道阻滞剂维拉帕米对体外培养神经瘢痕成纤维细胞形态学的影响.方法 Wistar大鼠10只,制作双侧坐骨神经损伤模型,术后 2 w取损伤处神经瘢痕,按组织块法培养神经瘢痕成纤维细胞,实验所用细胞为4～8代,分2组,维拉帕米组加入含维拉帕米的DMEM培养液,浓度为100 μmol/L,对照组不加药.48 h后进行Giemsa染色及制备扫描电镜标本,观察细胞形态学的变化.结果维拉帕米组成纤维细胞生长稀疏,胞体呈圆形,胞浆内有较多囊泡,细胞突起细小,网状物质较少;对照组成纤维细胞生长稠密,形态多样,多呈梭形或多角形,细胞间界限不清,互相连接或重叠,胞间网状基质较多,细胞突起粗大,胞间突起互相交联,胞浆内囊泡少见.结论维拉帕米能使体外培养神经瘢痕成纤维细胞趋于球形变,可能同时对成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌具有抑制作用.     

改良酸性品红苯胺蓝神经髓鞘染色法

髓鞘染色在病理诊断和研究中有很重要的意义。其染色方法很多,有的方法仅可显示染变性髓鞘或正常髓鞘。改良酸性品红苯胺蓝的神经髓鞘染色法既能显示变性髓,也可显示正常髓鞘。本染色法简便易行可靠适用。目前尚未见文献报道。1材料与方法1.1材料及主要仪器:大鼠周围神经10%中性印醛固定,石蜡包埋。Leica滑动式切片机。YT-60生物组织摊烤片机。1.2试剂配制:(1)丽春红品红液:丽春红0.7g;酸性品红0.3g;冰醋酸1ml,蒸馏水99ml。(2)苯胺蓝液:苯胺蓝1g,冰醋酸1ml,蒸馏水99ml。(3)冰醋酸水溶液:冰醋酸0.5ml,蒸馏水100ml。(4)磷钼酸水溶液:磷钼酸1…     

灵芝多糖肽对Alzheimer样大鼠海马超微结构和抗氧化能力的影响

目的 观察灵芝多糖肽(GLPP)对Alzheimer样大鼠海马超微结构、海马组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以及空间学习记忆能力的影响.方法 雄性Wistar大鼠60只,随机分为对照组、模型组、NS组、GLPP组,每组15只.除对照组(正常昼夜节律)外,其余各组每天连续光照(光照度400 Lux)24 h,共30 d.其间GLPP组每天1次灌胃 GLPP(250 mg/kg);NS组灌胃相同体积的生理盐水.光照30 d后Morris水迷宫法测试各组大鼠空间学习记忆能力,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量,透射电镜观察海马线粒体和突触结构的改变.结果 寻台潜伏期模型组大鼠较对照组明显延长(P＜0.05),GLPP组较模型组明显缩短(P＜0.05);NS组与模型组比较无显著差异.模型组较对照组海马SOD活性降低、MDA含量升高(P＜0.05);GLPP组较模型组SOD活性升高、MDA含量降低(P＜0.05);NS组SOD活性降低、MDA含量升高,与模型组比较无显著差异.透射电镜结果 显示:对照组、GLPP组大鼠海马线粒体神经轴突和神经突触基本正常;模型组和NS组大鼠海马线粒体膜结构破坏,线粒体肿胀,线粒体嵴模糊、消失,结构紊乱,神经髓鞘内神经细丝稀少,神经突触缺失、减少,突触密度降低,突触间隙不清,突触小泡减少.结论 GLPP可防止持续光照对大鼠海马超微结构的破坏和减轻Alzheimer样大鼠的空间记忆障碍.     

钙通道阻滞剂对大鼠坐骨神经损伤后局部胶原蛋白沉积的影响

目的 探讨周围神经损伤后钙通道阻滞剂维拉帕米对神经吻合口瘢痕形成的影响.方法 选用清洁级雄性SD大鼠120只,制作大鼠右侧坐骨神经损伤模型,并行神经外膜端端吻合术,术后随机分为实验组和对照组,每组60只.实验组每日腹腔注射盐酸维拉帕米4 mg/kg,对照组腹腔注射等量生理盐水,分别于术后4、12 w取材,进行Masson染色,Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维免疫组织化学染色,神经瘢痕胶原蛋白含量测定,并对实验结果进行图像分析和统计学处理.结果 实验组4 w和12 w两个时相点Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的沉积量明显减少(P<0.05),神经瘢痕中的胶原蛋白含量明显减少(P<0.01).结论 维拉帕米可以有效抑制神经损伤处瘢痕形成,减少胶原蛋白沉积,为再生的神经纤维提供良好的微环境.     

去细胞肌肉组织工程支架与人羊膜上皮细胞的相容性研究

目的 制作去细胞肌肉组织工程支架,并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性.方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架,冰冻切片观察其结构.将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后,用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT-3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构.结果 支架中细胞去除完全,其主要结构为平行排列的管状结构.细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好.羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性,并呈现NT-3、BDNF免疫反应阳性.扫描电镜显示,羊膜上皮细胞在支架中分布均匀,生长良好.结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架,其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性.