TGF-β1对口腔鳞癌相关成纤维细胞FAP表达的影响

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对癌相关成纤维细胞(CAFs)中成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达的影响.方法 应用10 ng/ml的TGF-β1作用于CAFs细胞,设置正常成纤维细胞(NFs)和未经处理的CAFs细胞作为对照组,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中FAP的蛋白和mRNA表达情况.结果 FAP在NFs中几乎不表达,而在CAFs中FAP的mRNA和蛋白表达均增加.与NFs组和CAFs组相比,10 ng/ml的TGF-β1能够明显促进CAFs细胞分泌FAP,作用12、24 h后FAP mRNA和蛋白的相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05).且随着作用时间的延长,FAP的表达持续升高,24 h较12 h表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能够促进CAFs中FAP的表达,在肿瘤上皮-间质交互作用中扮演着重要角色.     

VEGF-D在非小细胞肺癌中的表达与淋巴结转移关系的研究

目的:对VEGF-D在NSCLC肺癌组织及淋巴结组织中的表达进行研究,探讨VEGF-D在NSCLC淋巴管生成和淋巴结早期转移中的作用。方法:收集非小细胞肺癌患者术后肺组织标本52例,采用半定量RT-PCR的方法对NSCLC肺癌组织中及淋巴结组织中的VEGF-D mRNA的表达进行检测。结果:(1)VEGF-D mRNA在淋巴结转移阳性组的阳性淋巴结组织中的表达水平较淋巴结转移阴性组中阴性淋巴结中的表达水平降低(P<0.05)。(2)在淋巴结转移阳性组中VEGF-D mRNA在阳性淋巴结与阴性淋巴结中的表达水平无显著区别(P>0.05)。结论:VEGF-D mRNA的表达水平与肺癌淋巴结转移有显著的相关性,在预测肺癌的淋巴结转移,完善分子分期,指导临床治疗上有重要意义。     

乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。     

Biological characteristics of fibroblasts primarily cultured form breast precancerosis

目的 比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异.方法 采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度.比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21wafl及p53的变化.结果 获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P＜0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94 ±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P＜0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P＜0.05),p21wafl和p53蛋白表达降低(P＜0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P＜0.05),p21 wafl蛋白和p53蛋白表达更强(P＜0.05).结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段.     

miR-181c靶向己糖激酶2抑制癌相关成纤维细胞的糖酵解

目的探讨miR-181c在癌相关成纤维细胞（CAFs）糖酵解中的作用和机制。方法用组织贴壁法分离原代肺腺癌病人肺组
织CAF 及肺正常成纤维细胞（NFs）。用LipofectamineTM 2000 转染miR-181c mimics,miR-181c inhibitor,siRNA-HK2 和
HK2-vecto等;Q-PCR检测miR-181家族表达水平;Western blotting检测己糖激酶2（HK2）蛋白表达;2-NBDG法检测细胞葡萄
糖摄取率;DRY-CHEM FCD3500仪器检测细胞上清中乳酸生成;双荧光素酶报告基因系统检测HK2 mRNA表达。结果在细
胞形态上CAFs与NFs无明显区别。与NFs组相比,CAFs组葡萄糖摄取、乳酸生成和HK2蛋白表达明显增加,而miR-181家族
表达明显减少（P<0.05）。在NFs 转染inhibitor-181c 后,其HK2 蛋白表达、葡萄糖摄取和乳酸生成明显增加（P<0.05）;相反,
CAFs转染了mimics-181c后,其HK2蛋白表达、葡萄糖摄取和乳酸生成明显减少（P<0.05）。并且在敲低HK2细胞的CAFs中,
mimics-181c 不能减少葡萄糖摄取和乳酸生成;而mimics-181c 可以减少过表达HK2 对NFs葡萄糖摄取和乳酸生成的增强作
用。结论mir-181c可以通过抑制HK2的蛋白表达来抑制CAFs的糖酵解。
     

肿瘤相关成纤维细胞与上皮性卵巢癌顺铂耐药性的研究

目的 探讨卵巢癌相关成纤维细胞(CAFs)对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其可能作用机制.方法 收取上皮性卵巢癌及正常卵巢上皮组织各10例,分离纯化培养CAFs和正常卵巢成纤维细胞(NFs),免疫荧光法鉴定CAFs;收集CAFs或NFs培养上清液与卵巢癌SKOV3细胞建立间接共培养体系;C C K8法检测细胞增殖及顺铂毒性、划痕实验检测细胞迁移能力;DCFH-DA法测定共培养体系中活性氧(ROS)含量;qPCR及Western blot法检测共培养体系SKOV3细胞耐药相关基因YAP、CTGF和Cyr61在mRNA及蛋白水平表达.结果 成功分离培养CAFs或NFs,免疫荧光结果 显示CAFs中平滑肌激动蛋白-α(α-SMA)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达阳性;SKOV3细胞与CAFs间接共培养后其增殖能力(P<0.001)、顺铂半数抑制浓度(IC50)(P<0.01)、迁移能力(P<0.01)均较SKOV3细胞单独培养或与NFs共培养组增加,差异有统计学意义;CAFs共培养体系细胞中ROS含量增加(P<0.01),差异有统计学意义;CAFs共培养SKOV3细胞中耐药相关基因YAP(P<0.01)、CTGF(P<0.05)、Cyr61(P<0.01)在mRNA及蛋白水平较单独培养或与NFs共培养SKOV3中表达升高,差异有统计学意义.结论 CAFs可促进SKOV3细胞增殖、迁移,降低SKOV3细胞对顺铂敏感性.其机制一方面可能与ROS促进SKOV3细胞自噬相关;另一方面与卵巢癌细胞中耐药基因YAP、CT-GF及Cyr61表达上调有关.     

口腔鳞癌相关成纤维细胞糖代谢的初步研究

目的 通过对口腔鳞癌相关成纤维细胞(carcinoma-associate fibroblasts,CAFs)糖代谢相关指标的检测,探讨肿瘤微环境CAFs糖代谢的可能方式并分析其作用和意义.方法 培养CAFs和癌旁正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs),詹纳斯绿B染色观察线粒体的数量及分布,JC-1荧光染色观察线粒体膜电位的改变.培养1、2、3、4d,通过定磷法用可见分光光度计检测细胞中ATP的含量,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测细胞摄取葡萄糖的能力,乳酸酶法检测细胞分泌乳酸情况.结果 与NFs组相比,CAFs线粒体詹纳斯绿B和JC-1荧光染色强度明显下降,显示CAFs线粒体活性下降.随着培养时间的延长,CAFs较NFs组摄取葡萄糖增多,ATP产能却减少,分泌乳酸增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);以培养第4天差异更明显,CAFs和NFs组培养基葡萄糖浓度分别为(10.85 ±1.42)、(16.04±1.09) mmol/L,产生ATP浓度分别为(42.99 ±4.64)、(57.37±2.75) μmol/g,产生乳酸浓度分别为(12.1±0.81)、(7.06±0.95) mmol/L.结论 口腔鳞癌CAFs细胞糖代谢方式发生了改变,以糖酵解为主.     

口腔癌相关成纤维细胞侵袭特性研究

目的采用体外重建基底膜细胞侵袭实验,研究口腔癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）侵袭力,用免疫组织化学法,观察CAFs对相关蛋白的表达。探讨CAFs在口腔鳞癌中的病理意义。方法采用组织块贴壁法培养颊部正常成纤维细胞（Normal Fibroblasts,NFs）和癌相关成纤维细胞CAFs,利用包被matrigel的transwell小室模拟天然基底膜的结构,利用培养基浓度梯度差诱导细胞穿膜并计数穿膜细胞数量,比较CAFs和NFs的侵袭力差异。采用免疫组化法,比较CAFs和NFs对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2,MMP-2）和成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein,FAP）表达差异。结果 CAFs穿膜的细胞数量显著高于NFS（P〈0.05）,差异具有统计学意义。CAFs对MMP-2和FAP的蛋白表达阳性,NFs表达为阴性。结论口腔CAFs的体外侵袭能力明显高于NFs,且能特异性地分泌MMP-2和FAP蛋白。这提示肿瘤间质的侵袭特性可随着上皮癌变而同步激活,CAFs参与肿瘤细胞外基质的重建,与肿瘤侵袭转移有关。     

食管间质成纤维细胞与食管癌细胞相互作用的体外研究

目的 体外研究不同类型食管间质成纤维细胞与癌细胞株间接接触后其基因及生物学特性的改变.方法 检测人食管正常间质成纤维细胞(NFs)、不典型增生间质成纤维细胞(AFs)及癌相关纤维母细胞(CAFs)与癌细胞株间接相互接触前后的波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β(TGF-β1)、人肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA及食管癌细胞株的增殖细胞核抗原(PCNA) mRNA,并与食管癌细胞株进行侵袭实验.结果 从NFs到AFs再到CAFs,Vimentin mRNA的表达无差别,α-SMA、TGF-β1、HGF、MMP2及MMP9 mRNA的表达逐渐增强.在与食管癌细胞株间接接触后,NFs及AFs的α-SMA、TGF-β1、HGF、MMP2及MMP9 mRNA表达均上调,且差异有统计学意义(P＜0.05),而CAFs的相应mRNA表达无明显变化.食管癌细胞株的PCNA mRNA在与NFs接触后,无变化;而与AFs和CAFs接触后,PCNA mRNA表达明显上调.结论 食管癌细胞与食管间质成纤维细胞可影响对方的增殖活性及侵袭特性.     

透明质酸合酶-2在癌相关成纤维细胞促进舌癌细胞侵袭中的作用

目的:检测透明质酸合酶2 (hyaluronan synthase 2,HAS2) 在正常成纤维细胞(normal zone fibroblasts,NFs)及癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)中的表达,并探讨其在CAFs介导的舌鳞癌细胞系Cal27侵袭行为中的作用?方法:分别从同一舌癌患者手术切除标本的癌组织及癌旁组织获取CAFs和NFs?免疫细胞化学?Western blot法鉴定细胞表型?实时定量RT-PCR及Western blot检测透明质酸合酶在两种细胞中的表达?利用Transwell小室共培养模型,观察CAFs及NFs对舌癌细胞系Cal27侵袭能力的影响?利用siRNA抑制CAFs 中的HAS2,并分析其对Cal27侵袭能力的影响?结果:α-SMA表达于CAFs,NFs中几乎无表达?Cal27在CAFs组中的侵袭力显著高于NFs组及空白对照组(P < 0.01)?实时定量RT-PCR结果显示HAS2在CAFs中的表达是NFs的7倍(P < 0.01),蛋白水平则为NFs的3倍(P < 0.01);Cal27在HAS2干扰组的侵袭力显著低于CAFs组及无关序列组(P < 0.01)?结论:CAFs具有促进舌癌细胞侵袭能力的作用,高表达HAS2可能是其作用机制之一,抑制肿瘤微环境中CAFs的HAS2功能可能是一条新的抗肿瘤侵袭转移的途径?     

鼻咽癌VEGF-C、VEGF-D的表达及意义

①目的探讨鼻咽癌VEGF-C、VEGF-D的表达及其与鼻咽癌淋巴道转移的关系。②方法采用改良的S-P免疫组化法标记VEGF-C、VEGF-D。分析其表达与鼻咽癌生物学特性的关系。③结果VEGF-C、VEGF-D的表达与肿瘤淋巴结转移相关。④结论VEGF-C、VEGF-D可调控鼻咽癌淋巴管的生成,并为鼻咽癌患者的抗淋巴管生成治疗提供了科学依据。     

VEGF-C、VEGF-D及其受体FLt-4与大肠癌淋巴转移及预后的相关性研究

目的:研究VEGF-C、VEGF-D及其受体Flt-4在大肠癌组织中的表达规律,探讨其与大肠癌浸润特点、淋巴转移等生物学特性及预后的关系。方法:采用免疫组织化学染色法检测45例大肠癌组织中VEGF-C、VEGF-D及Flt-4表达情况,评估VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的表达与大肠癌生物学特性及预后的关系。结果:研究发现大肠癌组织VEGF-C和VEGF-D及其受体Flt-4阳性表达率显著高于正常组织(P<0.05)。并且VEGF-C/VEGF-D表达与Flt-4蛋白表达呈显著正相关(P<0.01)。VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的表达在有无淋巴管浸润组、有无淋巴结转移组及不同Dukes分期中亦有显著性差异(P<0.05),45例大肠癌患者术后5年生存率为53.3%。其中VEGF-C、VEGF-D和Flt-4阳性患者5年生存率均分别低于阴性患者组(P<0.05)。结论:在大肠癌组织中VEGF-C和VEGF-D与其受体Flt-4的表达与大肠癌淋巴管的发生及促进肿瘤细胞经淋巴管转移可能起一定作用,VEGF-C和VEGF-D表达的检测可作为预测大肠癌淋巴结转移的辅助指标;VEGF-C和VEGF-D蛋白高表达与大肠癌患者预后相关,可能成为今后大肠癌预后评估的分子指标之一。     

Role of vascular endothelial growth factor-C and -D mRNA in breast cancer

Vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D belong to the VEGF family, and are thought to be involved in lymphangiogenesis and angiogenesis. At present, this is the only known system that can induce lymphatic vessel growth in the body. However, the roles of VEGF-C and VEGF-D in breast cancer tissue have not been clarified. In the present study, we measured the mRNA expression of VEGF-C and VEGF-D in the breast cancer tissue of 109 patients by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Between non-infiltrating breast cancer (n=6) and infiltrating breast cancer (n=103), there were no significant differences in the mRNA expression of VEGF-C and VEGF-D. In infiltrating cancer, the expression of HER2 exhibited a positive correlation to VEGF-C and VEGF-D mRNA expression (p=0.027, p=0.048). However, mRNA expression ofVEGF-C and VEGF-D did not exhibit any significant correlation to lymphatic vessel invasion or lymph node metastasis. Among patients without lymph node metastasis, the mRNA expression of VEGF-C and VEGF-D for patients with lymphatic vessel invasion was significantly higher than that for patients without lymphatic vessel invasion (p=0.001, p=0.050). The results suggest that, in breast cancer, VEGF-C and VEGF-D are involved in lymphatic vessel invasion prior to lymph node metastasis, and their expression decreases after lymph node metastasis occurs.     

VEGF-D及Ki-67在乳腺癌淋巴结转移中的作用

目的探讨VEGF-D及Ki-67在乳腺癌淋巴结转移中的作用和意义。方法采用免疫组化二步法检测90例乳腺癌组织中VEGF-D和Ki-67的表达。结果①VEGF-D阳性率在淋巴结转移组为82%（41/50）,显著高于未转移淋巴组37.5%（15/40）,（P〈0.01）。Ki-67阳性率在淋巴结转移组为84%（42/50）,显著高于未转移淋巴组42.5%（17/40）,（P〈0.05）,且VEGF-D与Ki-67的表达显著相关（P〈0.05）;②VEGF-D的表达与年龄、肿瘤大小、病理分型、临床分级、ER、PR无关,与CerbB-2表达显著相关（P〈0.05）。Ki-67的表达与年龄、肿瘤大小无相关性（P〉0.05）,而与肿瘤组织分级、淋巴结转移有显著相关性（P〈0.05）。结论 VEGF-D和Ki-67的表达与乳腺癌淋巴结转移有关,可能促进了乳腺癌淋巴管的生成和增殖。     

VEGF-D及Ki-67在乳腺癌淋巴道转移中的作用

目的探讨VEGF-D及Ki-67在乳腺癌淋巴道转移中的作用和意义。方法采用免疫组化二步法检测90例乳腺癌组织中VEGF-D和Ki-67的表达。结果1）VEGF-D阳性率在淋巴结转移组为82％（41／50）显著高于未转移淋巴组37．5％（15／40）（P〈0．01）。Ki-67阳性率在淋巴道转移组为84％（42／50）显著高于未转移淋巴组42．5％（17／40）（P〈0．05），且VEGF-D与Ki-67的表达显著相关（P〈0．05）。2）VEGF-D的表达与年龄、肿瘤大小、病理分型、临床分级、ER、PR无关，与CerbB-2表达显著相关（P〈0．05）。Ki-67的表达与年龄、肿瘤大小无显著性相关（P〉0．05），而与肿瘤组织分级、淋巴结转移有显著相关性（P〈0．05）。结论VEGF-D和Ki-67的表达与乳腺癌淋巴道转移有关，可能促进了乳腺癌淋巴管的生成和增殖。     

VEGF-D在乳腺癌淋巴管生成中的作用及与预后的关系

目的探讨血管内皮生长因子D(VEGF-D)在乳腺癌淋巴管生成中的作用及其与临床病理指标及预后的关系。方法采用免疫组化法检测85例原发性乳腺癌VEGF-D的表达,以Podoplanin标记淋巴管内皮、计数淋巴管密度(LVD),采用RT-PCR法检测VEGF-D mRNA的表达。分析上述指标与临床病理指标及预后的关系。结果免疫组化检测显示,VEGF-D蛋白表达阴性5例(5.88%)、" "17例(20%)、" "34例(40%)、" "22例(25.88%)、" "7例(8.24%),其表达与淋巴结转移、临床分期相关(P<0.01),且导致较差的生存率(P<0.05)。LVD于不同表达程度的VEGF-D组间有显著差异(P<0.01),且随着VEGF-D表达的增加,LVD有上升的趋势。RT-PCR检测显示,VEGF-D mRNA在乳腺癌中的表达显著高于对照组(P<0.01),且其表达与淋巴结转移、临床分期和LVD相关(P<0.05)。结论VEGF-D在乳腺癌中具有一定的诱导淋巴管生成的作用,并与肿瘤的淋巴侵袭转移及预后相关。     

组织蛋白酶D对口腔鳞癌中VEGF-C和VEGF-D的影响及淋巴管生成作用的研究

目的检测组织蛋白酶D(Cath-D)对口腔鳞癌中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和血管内皮生长因子-D(VEGF-D)表达的影响,探讨其对淋巴管生成的作用。方法选择86例口腔鳞癌标本作为观察组,收集60例正常口腔黏膜组织作为对照组,应用流式细胞分析Cath-D、VEGF-C和VEGF-D蛋白在两组中的表达,关注其表达的相关性及临床价值。结果口腔鳞癌中Cath-D、VEGF-C和VEGF-D高表达,口腔鳞癌中Cath-D、VEGF-C和VEGF-D的表达与肿瘤的分化程度、炎细胞浸润及淋巴结转移的差别有统计学意义。口腔鳞癌中Cath-D与VEGF-C、Cath-D与VEGF-D均呈正相关。结论口腔鳞癌中Cath-D、VEGF-C和VEGF-D表达明显增加,Cath-D能促进VEGF-C和VEGF-D的表达,进而促进淋巴管的生成。联合检测Cath-D、VEGF-C和VEGF-D的表达可能对判断肿瘤的预后有参考价值。