环氧化酶-2抑制剂Celebrex对膀胱癌T24细胞株COX-2mRNA和PGE2表达的影响

【目的】探讨选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂Celebrex对膀胱癌T24细胞株COX-2mRNA和前列腺素E2（PGE2）表达的影响。【方法】体外培养人膀胱癌细胞株T24细胞，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，检测选择性COX-2抑制剂Celebrex与膀胱癌T24细胞株COX-2mRNA和PGE2表达的时间-效应关系和剂量-效应关系。【结果】Celebrex在一定时间和剂量范围内可明显抑制膀胱癌T24细胞株PGE2的表达，但Celebrex无论在时间-效应或剂量-效应关系上均不影响人膀胱癌T24细胞株COX-2 mRNA的表达。【结论】Celebrex对COX-2mRNA的表达无明显影响，主要是通过抑制COX-2酶及其主要代谢产物PGE2的表达而发挥抗肿瘤效应。     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。     

人巨细胞病毒UL123基因全长及其外显子4的克隆与表达

【目的】克隆人巨细胞病毒（HCMV）UL123基因cDNA全长（iel）及其外显子4（iel-exon4），构建原核表达重组质粒，诱导立即早期蛋白1（IE1）及其C-端86-491氨基酸（IE1-C86-491）表达，并鉴定表达产物。【方法】分别用RT-PCR和PCR法将iel和iel-exon 4从感染了HCMV的人胚肺成纤维细胞（HEL）中扩增出来，再分别克隆入原核表达载体pTWIN1上intein2的N端，转化大肠杆菌，经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子，在低温和低IPTG浓度下诱导重组子表达可溶性重组融合蛋白rIE1／intein2和rIE1-C86-491／intein2，用SDS-PAGE和Western Blotting对表达产物进行鉴定。【结果】经PCR、限制性酶切和测序鉴定重组质粒pTWIN1／iel和pTWIN1／iel-exon4构建成功，sDS-PAGE和Western Blotting分析表明融合蛋白在大肠杆菌中表达。【结论】成功克隆并表达了iel和iel-exon4。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

pTracer-CMV／Bsd-BDNF真核表达载体的构建及表达

【目的】构建人脑源性神经营养因子（BDNF）基因真核表达载体,并在小鼠耳蜗毛细胞与螺旋神经节细胞（SGCs）表达。【方法】应用RT‐PCR从人外周血中扩增BDNF基因开放阅读框（ORF）,采用 TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm‐T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm‐T‐BDNF。随后,将BDNF进一步克隆到真核表达载体pT racer‐CM V／Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pT racer‐CM V／Bsd‐BD‐NF质粒转染小鼠耳蜗SGCs细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染SGCs细胞,经杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选4周,用Western blot检测BDNF的表达。【结果】成功构建了pTracer‐CMV／Bsd‐BDNF真核表达质粒,转染SGCs细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;Western blot检测结果表明,所转染的BD‐NF在SGCs细胞中成功表达。【结论】成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和BDNF的真核表达质粒pTracer‐CMV／Bsd‐BDNF ,为进一步研究BDNF在内耳基因治疗中的作用奠定了基础。     

重组质粒pEGFP-N3-APC在结肠癌细胞株HT-29中的表达

【目的】构建含有APC蛋白功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒,转染结肠癌细胞HT-29,观察重组质粒的表达。【方法】设计引物分别扩增5条APC基因功能区域片段。将扩增片段与pEGFP-N3载体连接后挑取阳性克隆,行菌落PCR和测序鉴定。使用Lipofectamine 2000将重组质粒转染结肠癌细胞株HT-29,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。【结果】构建5条带有APC不同结构域重组真核表达载体pEGFP-N3-APC,重组真核表达载体转染HT-29细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达。【结论】真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。     

CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究

为了构建负载CML28的核酸疫苗，并在树突状细胞中进行表达，用分子克隆的方法，从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长，将其亚克隆至pGEM—T载体，经测序后酶切，克隆至真核表达载体pcDNA3．1HisA，将重组质粒pcDNA3．1HisA—CML28进行酶切分析和测序鉴定；从正常人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），在IL-4和GM—CSF条件下诱导分化为树突状细胞（DC），并进行鉴定；用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28导入到DC中，Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达。结果表明：经酶切分析和测序鉴定，重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28含有正确的CML28全长序列；经电穿孔导入Dc后，重组质粒能表达His—CML28蛋白。结论：成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

构建具有突变铜-锌超氧化物歧化酶绿色荧光真核表达载体

目的:构建一个具有特殊临床表型的肌萎缩侧索硬化症家系的突变铜-锌超氧化物歧化酶与有增强绿色荧光蛋白基因的pEGFP-N1融合的真核表达载体。方法:实验于2003-09/2005-01在第三军医大学全军免疫学研究所完成。通过RT-聚合酶链扩增突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA,应用基因重组技术,将得到的突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N1中,转化DH5α感受态细胞,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切分析、测序鉴定。结果:提取到纯度较高的总RNA,通过RT-聚合酶链和基因重组得到重组质粒,应用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切重组质粒,得到长约130bp和4.6Kb的两条带,前者为插入片段的长度,后者为pEGFP-N1载体本身的长度。测序也最终证实重组载体的方向及序列正确。结论:突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA成功地亚克隆至荧光真核表达载体pEGFP-N1中,获得突变铜-锌超氧化物歧化酶/pEGFP-N1重组质粒,从而为实时监测突变铜-锌超氧化物歧化酶基因在体内的表达和蛋白定位提供一个有用的工具载体。     

Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤中的表达

目的:构建Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达情况。方法:实验于2003-07/12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室完成。利用原核表达质粒pUChIGF-I,通过分子克隆技术扩增Ⅰ型胰岛素样生长因子基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子。取20只Wistar大鼠,全麻后背部浸入95℃水浴锅中,烫伤12s,造成30%Ⅲ度烫伤,烫伤后随机分为两组(n=10),即cDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组及pcDNA3.1组。①pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组:烫伤后当天及第1,2,3,4周后于大鼠左后背部创面边缘(距创面边缘0.5cm)皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL眼3.6μgpcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水演。②pcDNA3.1组:注射时间和方法同前,脂质体和质粒混合物为3.0μgpcDNA3.1穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠,取注射点附近皮肤,应用免疫组化方法检测Ⅰ型胰岛素样生长因子基因的表达情况。结果:20只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致,DNA测序结果表明Ⅰ型胰岛素样生长因子基因已分别正确插入到pcDNA3.1质粒,提示成功构建了重组真核表达载体。②pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组大鼠皮肤组织中Ⅰ型胰岛素样生长因子呈现强阳性表达,pcDNA3.1组大鼠呈表达缺失或弱阳性表达。结论:应用分子克隆技术可以成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,Ⅰ型胰岛素样生长因子在烫伤大鼠皮肤中呈阳性表达。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

维生素D受体野生型及FokⅠ突变型真核表达载体的构建

目的:克隆人维生素D受体(VDR)全长,构建VDR野生型及FokⅠ突变型重组真核表达质粒.方法:提取总RNA,RT-PCR方法扩增将产物用EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切后与pcDNA3.1(-) B-myc/his载体连接形成重组载体;对野生型VDR基因行定点诱变,构建突变型FokⅠ VDR质粒.结果:重组质粒被酶切为两条带,一条为1 300 bp(代表人VDR),一条为5 500 bp(空载体);片段大小与理论值相符.测序结果与Genbank序列完全相同.结论:成功克隆了人VDR基因全长并成功构建了人野生型和突变型FokⅠVDR重组真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his hVDR,为进一步研究VDR基因变异与相关肿瘤易感性的分子机制奠定了实验基础.     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要.目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础.方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定.结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达.成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达.     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

真核表达载体pcDNA3-ICOSIg的构建及表达

背景：人可诱导共刺激分子0cos）是迄今发现的重要共刺激分子家族成员,可促进激活T细胞的增殖和分泌、调节Th1／Th2细胞的极化、增强依赖T细胞的B细胞功能,阻断ICOS共刺激信号会导致T细胞的克隆失活或克隆无反应,从而诱导肿瘤对机体的免疫逃逸。目的：构建表达ICOSIg的质粒,观察其在小鼠体内的表达。方法：克隆编码ICOS的胞外片段,将其与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3-ICOSIg,酶切鉴定重组子,测序,利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-ICOSlg转染小鼠右侧大腿肌肉组织,Westernblot法检测血清ICOSIg水平。结果与结论：经测序鉴定证实pcDNA3．ICOSIg质粒目的基因片断与Genbank上公布的ICOS序列完全一致,说明质粒构建成功。脂质体载体包被pcDNA3-ICOSIg转染小鼠7d,在小鼠血清中检测到ICOSIg的阳性表达,说明pcDNA3．ICOSlg能够在小鼠肌细胞内表达。证实利用基因合成和重组技术可成功构建真核表达载体pcDNA3-ICOSIg。f201