AMPK的激活调节COX-2对HT-29细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究AMPK的激活在结肠癌HT-29细胞中对COX-2表达的影响, 并探讨其对细胞增殖和凋亡的作用.方法:用Western Blot方法检测AMPK的激活对COX-2表达的影响,MTT法检测不同浓度、时间的AMPK激活荆AICAR和选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用下的细胞存活率, 流式细胞术检测细胞凋亡率,用MTT法检测二者联合对细胞增殖的影响.结果:AMPK被激活后COX-2蛋白表达减少,随着AICAR和塞来昔布作用浓度、时间增加,细胞存活率呈剂量和时间依赖性下降,塞来昔布组和AICAR组凋亡细胞增多,早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞比例均高于对照组(P＜0.05),AICAR和塞采昔布联用后细胞的存活率为(23.0±0.82)%.均低于AICAR组(54.0±2.86)%和塞来昔布组(57.0±2.54)%.结论:AMPK激活可以抑制COX-2表达对人结肠癌HT-29细胞产生增殖抑制和凋亡诱导效应,AICAR和塞来昔布二者联用具有协同作用.     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。     

ROR1-AS1调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响

摘 要：［目的］ 研究酪氨酸蛋白激酶跨膜受体 1 反义 RNA 1（tyrosine protein kinase transmembrane receptor 1 antisense RNA 1，ROR1-AS1）调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响。［方法］ 实时荧光定量PCR方法检测乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞和正常乳腺上皮MCF10A细胞中ROR1-AS1表达变化。乳腺癌MCF-7细胞分成对照、sh-NC（转染shRNA 对照）、sh-ROR1-AS1（转染ROR1-AS1 shRNA）、sh-ROR1-AS1+Jagged1组（转染ROR1-AS1 shRNA，Notch1通路激活剂Jagged1处理）。CCK-8实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭，Western blot方法检测细胞中活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶9（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-9，C-Caspase-9）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，C-Caspase-3）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、Notch1、Hes1蛋白表达。 ［结果］ 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞中ROR1-AS1水平明显高于正常乳腺上皮MCF10A细胞（P<0.05）。与对照组、sh-NC组比较，sh-ROR1-AS1组乳腺癌MCF-7细胞存活率降低(100.00%±9.82%，99.74%±12.05%，58.91%±6.33%)，细胞凋亡率升高(4.81%±0.26%，4.93%±0.34%，20.58%±2.11%），细胞迁移数目( 225.36±12.84个，224.89±19.56个，140.89±13.64个）和侵袭数目(180.47±16.32个，177.54±16.92个，110.44±10.87个)减少，细胞中C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白表达水平增加，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白表达水平降低（P<0.05）。与sh-ROR1-AS1组比较，sh-ROR1-AS1+Jagged1组乳腺癌MCF-7细胞存活率升高(100.00%±11.58% vs 147.36%±12.05%），细胞凋亡率降低(19.54%±1.74% vs 8.36%±0.75%)，细胞迁移数目(139.58±12.78个 vs 175.26±16.94个)和侵袭数目（107.45±9.35个 vs 162.04±13.67个）均升高，C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白水平降低，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白水平升高（P<0.05）。［结论］ 下调ROR1-AS1通过抑制Notch1信号减弱乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT能力，激活细胞凋亡。     

腺苷酸活化蛋白激酶增强乳腺癌对多柔比星化疗敏感性的机制

背景与目的：腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在调控细胞代谢和能量平衡方面起着重要作用,并与细胞增殖、生存和多种信号通路密切相关。近年来发现AMPK参与肿瘤的抑制和耐药。该研究旨在探讨AMPK对多柔比星抑制乳腺癌作用的影响及其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(meth-ylthiazolyl tetrazolium,MTT)法检测多柔比星作用后对MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞增殖的影响;Hoechst染色法观察各组细胞凋亡形态;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测各组细胞凋亡率;荧光酶标仪检测3组细胞多柔比星累积量;蛋白[质]印迹法(Western blot)检测各组细胞中耐药蛋白及凋亡相关蛋白的表达。结果：多柔比星对MCF-7/adr细胞增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(36.8±2.1)和(28.8±1.3)μg/mL。过表达AMPKα可增加多柔比星对MCF-7/adr细胞的生长抑制作用,呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(16.0±0.7)和(4.2±0.2)μg/mL。荧光形态分析发现多柔比星联合AMPKα能诱导MCF-7/adr细胞凋亡。1.0μg/mL多柔比星作用48 h后,MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞的凋亡率分别为(12.0±1.4)%、(12.7±1.6)%和(32.0±4.2)%,MCF-7/adr细胞中AMPKα过表达明显提高MCF-7/adr细胞对多柔比星的敏感性。荧光酶标仪检测显示,过表达AMPKα能明显提高细胞内多柔比星的累积量,具有浓度依赖性。Western blot实验结果显示,与MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector细胞比较,MCF-7/adr-AMPKα细胞中Bax、细胞色素c(Cyto c)的释放、caspase-3和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶降解产物(cleaved PARP)蛋白表达明显增加,而细胞外排泵P-糖蛋白(P-gp)和Bcl-2蛋白表达降低。结论：AMPKα可通过抑制耐药细胞外排泵以及调控凋亡相关蛋白的表达,从而增强乳腺癌耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性。     

YC-1抑制人类白血病细胞株 U937、THP-1增殖作用的研究

 【摘要】　目的　探讨YC-1对人类白血病细胞株U937和THP-1增殖、凋亡、周期及Caspase-3、-8、-9蛋白表达的影响。方法　实验分为YC-1组（1.0、3.0、10.0 μmol／L）,以不加YC-1组为对照。四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法检测细胞增殖;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡及周期;Western blot检测Caspase-3、-8、-9蛋白表达的变化。结果　1.0、3.0、10.0 μmol／L YC-1以剂量依赖方式抑制U937、THP-1细胞增殖,24 h细胞存活率分别为（76.5±4.4）%、（68.7±6.8）%、（60.9±13.2）%,（94.1±1.4）%、（81.4±2.0）%、（72.7±3.0）%,与对照组的100 %比较差异均有统计学意义（F＝15.870、126.629,均P＜0.01）。U937、THP-1细胞经1.0、3.0、10.0 μmol／L YC-1作用24 h后,凋亡率分别为（40.7±1.0）%、（55.6±2.3）%、（71.8±1.5）%,（34.6±2.0）%、（50.3±3.5）%、（59.6±4.6）%,与对照组的（4.7±1.4）%、（1.8±1.0）%比较差异均有统计学意义（F＝937.229、200.447,均P＜0.01）,但细胞周期无明显变化。经1.0、3.0、10.0 μmol／L YC-1作用24 h后,U937细胞Cleaved Caspase-3、-8蛋白表达上调,Caspase-9无变化,THP-1细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达上调,Caspase-8、-9无变化。结论　YC-1能够抑制U937、THP-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,但对周期无影响,其诱导白血病细胞凋亡的机制可能与Caspase蛋白活化有关。     

靶向survivin的siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡

目的 观察靶向survivin的siRNA对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建靶向survivin的siRNA真核表达载体,采用Lipofectamine^TM2000转染乳腺癌细胞MCF-7,采用半定量RTPCR、免疫组化技术检测转染前后MCF-7细胞survivin基因表达的变化;采用MTT法检测对MCF-7细胞增殖的抑制作用;采用TUNEL法检测诱导MCF-7细胞凋亡的作用。结果靶向survivin的序列特异性siRNA可以高效抑制MCF-7细胞survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为64．9％;在蛋白质水平其表达抑制率为79．7％;转染靶向survivin的siRNA真核表达载体可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,细胞重新接种24、48h后,其增殖抑制率分别为31．6％和33．0％;转染后24h可以诱导12．9％的细胞凋亡。结论利用RNA干扰技术阻断survivin基因的表达可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,靶向survivin的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

iRNA沉默Chk1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响及其作用机制的探讨

目的 探讨siRNA沉默检测点激酶1（Chk1）基因对乳腺癌细胞MCF 7增殖和周期的影响及其作用机制。方法 采用RNAi技术将乳腺癌细胞MCF 7中Chk1基因沉默,用Western blotting检测转染前后MCF 7细胞中Chk1蛋白表达情况;采用MTT比色法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7增殖和周期的影响。结果 Chk1 siRNA转染后,MCF-7细胞中Chk1蛋白表达下降约82％,明显低于未转染组和脂质体转染组（P＜0.05）。Chk1 siRNA转染组转染48h的MCF-7细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为44.7％,明显高于脂质体转染组的5.26% （P＜0.05）。流式细胞仪检测显示,Chk1 siRNA转染组G2／M期比例为（11.3±0.7）％,明显低于未转染组（44.2±1.9）％和脂质体转染组（45.3±2.1）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 siRNA沉默Chk1基因可明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并且其抑制增殖作用与减弱G2／M期阻滞有关。     

低频率超声对MCF-7/DOX细胞多药耐药逆转的体外研究*

目的:观察低频率超声空化效应对人乳腺癌细胞株MCF-7/DOX 多药耐药的逆转作用,并探讨其逆转肿瘤多药耐药的机制。方法:以不同的超声辐射时间照射MCF-7/S 、MCF-7/DOX 细胞,采用MTT 法筛选出非细胞毒剂量的超声照射时间。以无毒剂量的超声照射联合不同浓度的DOX,比较单独DOX组与联合组MCF-7/DOX 细胞对DOX的IC 50值有无明显差异,从而判断低频率超声的增敏作用,并计算增敏倍数和相对逆转效率。用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞内阿霉素的浓度。结果:低频率超声辐射对MCF-7/DOX 细胞具有一定的细胞毒作用,其非细胞毒辐射时间是10s。非细胞毒性的超声辐射可显著增加阿霉素对MCF-7/DOX 细胞的抑制率（从21.65%±0.05% 升至43.13%±0.19%）,可显著降低阿霉素对MCF-7/DOX 细胞的IC 50 （从61.08± 0.27μg/mL降至 28.12± 5.94μ g/mL）;对MCF-7 细胞的抑制率（从66.47% ± 0.02%升至 67.25% ± 0.20%）及IC 50 （从0.84± 0.07μ g/mL 降至 0.802 ±0.03μ g/mL）无明显的影响。低频率超声对MCF-7/DOX 细胞的逆转倍数为2.17倍,相对逆转效率为:54.71% 。流式细胞仪检测结果显示:单独应用DOX,MCF-7 细胞的凋亡率为33.99% ,MCF-7/DOX 细胞的凋亡率为4.4% ,低频率超声与DOX合用后,MCF-7/DOX凋亡率为13.70% 。低频率超声处理后,MCF-7/DOX 细胞内DOX浓度显著增加,峰值明显右移,但尚不能达到敏感细胞的水平。结论:低频率超声可部分逆转人乳腺癌MCF-7/DOX 细胞对阿霉素的耐药性,其逆转机制考虑为低频率超声空化效应增加细胞膜的通透性,增加肿瘤细胞内抗肿瘤药物的浓度,从而杀灭耐药的肿瘤细胞,逆转肿瘤耐药性。      

survivin—siRNA联合化疗药物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及逆转耐药的研究

目的观察靶向survivin的siRNA联合紫杉醇和表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及逆转耐药的影响。方法构建靶向survivin的siRNA表达质粒,转染乳腺癌MCF。7细胞,荧光定量聚合酶链反应（PCR）,Westernblot技术检测转染前后survivin基因表达的变化,CCK．8法检测靶向survivin的siRNA联合紫杉醇、表柔比星对MCF-7细胞药物敏感性的影响,利用流式细胞术检测细胞凋亡作用。结果survivin—siRNA-2能有效抑制survivinmRNA（0．30±0．03）和蛋白的表达（0．37±0．09）（P〈0．05）;紫杉醇[24、48h抑制率分别为（38．5±4．0）％、（41．7±6．3）％]、表柔比星[24、48h抑制率分别为（37．0±8．6）％、（40．6±12．1）％1均可抑制MCF-7细胞增殖并诱导部分细胞凋亡;当与survivin—siRNA联合时上述作用显著加强f紫杉醇24、48h抑制率分别为（76．0±2．9）％、（85．1±4．0）％;表柔比星24、48h抑制率分别为（74．6±5．6）％、（82．5±4．8）％1（P〈0．05）,并且细胞抑制率呈现时间、剂量依赖性。结论利用RNA干扰阻断survivin基因表达同时联合相应化疗药物可以显著增强MCF-7细胞对药物敏感性并促进其凋亡,该方法在乳腺癌治疗中具有潜在的临床应用价值。     

Bcl-w对膀胱肿瘤细胞5637增殖、顺铂敏感性的影响

[目的]探讨过表达的Bcl-w蛋白对膀胱肿瘤细胞5637的增殖能力、顺铂敏感性的影响。[方法]采用质粒pcDNA3.1（＋）构建Bcl-w过表达载体,转染5637细胞后用Western blot验证过表达效果,用CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞仪检测pcDNA3.1-Bcl-w细胞和对照组细胞的增殖和生存曲线、克隆形成能力、细胞周期。[结果]成功构建pcDNA3.1-Bclw重组质粒并转染5637细胞。pcDNA3.1-Bcl-w细胞增殖曲线在24、48、72h均高于对照组（0.814±0.022 vs 0.727±0.017,P=0.006;1.259±0.017 vs 1.078±0.027,P=0.001;1.787±0.024 vs1.520±0.021,P〈0.001）,差异具有统计学意义;克隆形成能力高于对照组（60.67±6.03 vs48.67±6.11,P〈0.001）,差异具有统计学意义;处于G0/G1期的比例低于对照组（50.76%vs57.02%,P〈0.001）,差异具有统计学意义;在30、50、70、90、110μmol/L各浓度顺铂处理下生存曲线高于对照组[（83.8%±1.7%）vs（93.9%±1.2%）,P〈0.001;（59.5%±0.7%）vs（72.5%±1.9%）,P=0.028;（50.5%±2.2%）vs（57.2%±1.2%）,P=0.007;（37.2%±0.7%）vs（45.7%±1.4%）,P〈0.001;（29.1%±0.5%）vs（33.2%±0.6%）,P〈0.001],差异具有统计学意义。[结论]高表达的Bcl-w增强了膀胱癌细胞5637的增殖能力,削弱了肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性。     

哇巴因诱导MCF-7自噬作用与机制探讨

目的探讨哇巴因诱导人乳腺癌细胞MCF-7发生自噬的作用以及分子机制。方法 MTT法和克隆形成实验测定哇巴因对MCF-7细胞增殖活力及克隆形成能力的影响,吖啶橙染色结合荧光显微镜及流式细胞术观测细胞内形态的变化及FL3/FL1荧光强度比值,蛋白质印迹法检测细胞内抗微管相关蛋白1轻链3（Light chain 3,LC3）-Ⅱ及p62蛋白表达水平的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平的变化。结果哇巴因处理MCF-7细胞24h后半数抑制浓度（IC50）为（37.1±9.0）nmol/L。25nmol/L哇巴因处理12、24、48和72h后细胞存活率组间F=12.787,P〈0.001;与对照组比较差异均有统计学意义,P值均〈0.01。哇巴因处理2周后给药组较对照组相对克隆形成率降至（6.03±1.51）%,差异有统计学意义,F=635.800,P〈0.001。吖啶橙染色及蛋白质印迹结果显示,经25nmol/L哇巴因处理48h后,胞质中出现呈亮红色荧光的酸性囊泡,并伴随LC3-Ⅱ呈时间依赖性的蓄积及p62表达的下降;在12、24和48h时,相对FL3/FL1比值组间F=62.226,P〈0.001;与对照组比较差异均有统计学意义,P值均〈0.05。哇巴因能同时引起细胞内ROS水平呈时间依赖性升高;0.5、1、2、4、6、12和24h时ROS水平组间F=112.901,P〈0.001;与对照组比较,除0.5h组差异无统计学意义外,其余各组均差异有统计学意义,P值均〈0.05;给药同时使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）后,联合给药组较给药组相对ROS水平降低至（101.2±17.5）%,与给药组比较差异有统计学意义,F=185.870,P〈0.001;并且LC3-Ⅱ表达水平随之下降,而IC50值增加为（81.4±4.5）nmol/L,差异有统计学意义,F=57.610,P〈0.01。结论哇巴因能够诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生自噬,其作用机制可能与促进细胞内ROS生成有关。     

RNA干扰RSK4基因表达对裸鼠移植瘤生长与转移影响观察

目的：应用慢病毒干扰载体（RSK4-RNAi—LV）干扰RSK4基因在乳腺癌细胞株MCF-7中的表达,研究RSK4基因被干扰后对裸鼠移植瘤生长及转移的影响。方法：将转染了siRNA（RSK4-RNAi—LV）的MCF-7细胞组（实验组）、转染了siRNA（NC—GFP-LV）的MCF_7细胞组（阴性对照组）和未转染的MCF-7细胞组（空白对照组）分别接种至裸鼠乳腺脂肪垫下,建立裸鼠移植瘤模型,观察每纽裸鼠移植瘤生长情况;应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测3组移植瘤组织中RSK4mRNA及其蛋白的表达;HE染色观察3纽裸鼠内脏转移情况。结果：实验纽的移植瘤平均体积为（2264．08±367．47）mm2,明显大于阴性对照组（843．67±318．13）mm。及空白对照组的（720．45±241．35）mm。差异有统计学意义,F=112．425,P=0．02;实验组瘤体平均体质量为（1．44±0．25）g,明显重于阴性对照组（0．73±0．20）g及空白对照组的（0．70±0．21）g,差异有统计学意义,F=89．54,P=0．01。实验组裸鼠移植瘤肺转移6只,空白对照及阴性对照组各1只。实验组肿瘤组织RSK4mRNA的相对表达量为0．140±0．843,明显低于阴性对照组的1000±0．000（P=0．008）和空白时照组的0．878±0．689（P=0．005）。实验组、阴性对照组和空白对照组RSK4蛋白的表达量分别为0．138±0．023、0．532±0．032和0．465±0．057,3组间差异有统计学意义,F=73．1,P=0．003;实验组RSK4蛋白表达量明显低于阴性对照组（P=0．006）和空白对照组（P=0．012）。结论：慢病毒干扰MCF-7细胞中RSK4基因表达能促进MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长及转移。     

RNA干扰HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）沉默HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞株增殖、凋亡的影响。方法设计合成针对HOXA9的特异性siRNA寡核苷酸链,应用阳离子脂质体介导瞬时转染U937细胞。实验分为3组：实验组（脂质体转染靶向HOXA9的siRNA）、阴性对照组（脂质体转染阴性对照siRNA）和细胞对照组（仅加等量细胞及培养液）。利用反转录．聚合酶链反应法、Western blot法分别检测各组细胞HOXA9 mRNA、蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果转染靶向HOXA9的siRNA后,实验组、阴性对照组、细胞对照组mRNA相对表达水平分别为、（22.980±0．548）％、（82．371±1．517）％、（8d．637±2．252）％（P〈0．05）,蛋白相对表达水平分别为（50．377±2．773）％、（102．275±3．898）％、（107．510±3．905）％（P〈0．05）;siRNA转染后实验组U937细胞增殖明显受抑制且细胞凋亡率显著增高,24、48、72h增殖抑制率分别为（41．909±4．333）％、（54．470±3．756）％、（65．835±1．024）％,凋亡率为（26．800±2．081）％,与细胞对照组、阴性对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论靶向HOXA9的siRNA可有效沉默U937细胞HOXA9基因表达,明显抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡,为临床白血病HOXA9基因靶向治疗提供了实验依据。     

乳腺癌细胞耐药过程中p38MAPK活性与细胞凋亡的关系

目的研究乳腺癌细胞耐药过程中p38MAPK活性与细胞凋亡的关系,探讨p38MAPK信号转导途径在其中的作用。方法 以p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理乳腺癌耐药细胞MCF-7／ADM,采用流式细胞技术分析对细胞凋亡的影响;MTT检测MCF-7／ADM细胞对阿霉素的半数药物抑制浓度（IC50）;Western blot检测SB203580处理MCF-7／ADM和MCF-7两株细胞后p38MAPK蛋白表达水平;RT—PCR检测细胞内MDR-1 mRNA水平。结果SB203580（10μmol／L）干预24h后MCF-7／ADM细胞的凋亡率为（26．73±4．90）％,与未干预组和对照组凋亡率相比差异有显著统计学意义（F=143．80,P〈0．001）;MCF-7／ADM细胞对阿霉素的敏感性明显提高（F=148927．10,P〈0．001）,相对逆转率达68．45％;与对照组和未干预组相比,干预组的MDR1 mRNA（F=9139．24,P〈0．001）及p38MAPK（F=685．42,P〈0．001）蛋白表达水平明显降低。结论p38MAPK信号转导途径与乳腺癌耐药密切相关,其可能机制为p38MAPK保护人乳腺癌耐药细胞（MCF-7／ADM）逃避凋亡,阻断该通路可增强乳腺癌耐药细胞发生凋亡。     

SS-PEI/核酸纳米复合物的构建分析

目的：构建一种可生物降解的基因载体,并观察其体外转染DNA/siRNA的效率和细胞毒性。方法：采用低分子质量PEI与3,3′-二硫代二丙酸在催化剂作用下合成可降解的PEI衍生物SS-PEI,用红外波谱仪和核磁波谱仪分析其化学结构;动态光散射分析动态光散射（dynamic light scattering,DLS）SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的粒径;采用流式细胞技术（FCM）和荧光激活细胞分类术（FACS）分别分析SS-PEI对GFP-DNA和FAM-dsRNA的转染率;通过GFP表达水平分析SS-PEI对GFP质粒和GFP-siRNA的转染效率;采用考马斯蓝法分析SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的细胞毒性。结果：红外波谱和核磁波谱与SS-PEI理论波谱一致;DLS结果显示,SS-PEI/DNA复合物粒径为95~175nm,SS-PEI/siRNA平均粒径约200nm。FCM结果显示,SS-PEI对DNA的最大转染率为（25.2±2.3）%,稍低于HWPEI组的（33.8±3.1）%;SS-PEI/GFP-DNA转染后GFP的表达水平与HWPEI转染组接近〔（150±7）FI（A.U.）/mg蛋白vs（168±18）FI（A.U.）/mg蛋白〕,差异无统计学意义,t=1.62,P=0.18;细胞毒性分析显示,SS-PEI/DNA组细胞活力（89±5.2）%,显著高于HWPEI/DNA组的（70±4.9）%,差异有统计学意义,t=4.61,P=0.001。FACS结果显示,SS-PEI对FAM-dsRNA的转染率为（86.5±2.5）%;SS-PEI转染GFP-siRNA,靶基因GFP被显著敲除,相对表达水平为（42±3.5）FI（A.U.）/mg蛋白,与对照组的（79±10.8）FI（A.U.）/mg蛋白相比差异有统计学意义,t=5.64,P=0.004。结论：SS-PEI的合成可明显提高装载核酸的效率,具有低毒和高效等特点。     

地西他滨联合柔红霉素对HL-60细胞株凋亡作用的探讨

目的观察小剂量地西他滨（DAC）单用或联合柔红霉素（DNR）对白血病细胞株HL-60的凋亡作用及对抑癌基因PTENmRNA表达的影响。方法以不同浓度的DAC、DNR单药及联合处理HL．60细胞株,应用四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）法、流式细胞术检测不同时相药物对细胞的凋亡作用;采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）技术检测不同浓度组中HL-60细胞PTENmRNA表达。结果DAC、DNR单药对HL-60细胞的生长抑制作用呈剂量、时间依赖性,联合用药组的抑制作用则更为明显[72h抑制率为（80．23±1．71）％,P〈0．001];5．0μmol／LDAC联合1．0μmol／LDNR作用72h细胞凋亡率最高,抑制作用均较DAC和DNR单药组明显（F=30．199,P〈0．001）;不同浓度DAC与DNR联用后,细胞PTENmRNA表达量增加,呈浓度依赖性,明显高于对照组及DNR单药组（F=578．218,P〈0．001）。结论DAC能显著抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,与DNR联合对HL-60细胞增殖抑制作用有协同效应,其机制可能与DAC的去甲基化作用使PTENmRNA的表达量增加有关。     

靶向VEGF的不对称siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的:探讨靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果。方法:设计靶向VEGF的4种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),包括对称siRNA(siRNA21/21,siRNA23/23)与不对称siRNA(asymmetric siRNA,aiRNA;aiRNA21/23,aiRNA19/21)。siRNA转染入MCF-7细胞后,MTT及流式细胞术检测MCF-7细胞增殖及凋亡情况,RT-PCR、ELISA法检测MCF-7细胞中VEGF基因和蛋白的表达。结果:与对照组相比,aiRNA21/23、siRNA23/23、aiRNA19/21、siRNA21/21这4种siRNA都能有效抑制VEGF mRNA的表达[(71.4±5.01)%、(40.0±3.11)%、(37.2±2.79)%、(11.1±0.99)%vs(2.4±0.11)%,P<0.01],且抑制MCF-7细胞的增殖[(44.7±5.38)%、(38.5±5.67)%、(33.6±2.18)%、(33.1±3.18)%vs(2.2±0.28)%,P<0.01],其中以不对称aiRNA21/23的抑制效果最明显。与对照组比较,aiRNA21/23显著促进MCF-7细胞的凋亡[(49.9±4.02)%vs(4.7±0.91)%,P<0.01]。结论:靶向VEGF基因的siRNA可抑制MCF-7细胞的增殖、促进细胞凋亡,尤以不对称siRNA的效果最明显。