高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。方法:在高温致神经管畸形动物模型上,提取高温致畸金黄地鼠胚胎神经管总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成cDNA第1链,经LD-PCR合成全长双链cDNA,去除小于500 bp的片断后与λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成未扩增cDNA文库,再进行文库扩增。测定未扩增和扩增文库的滴度及重组率;随机挑取噬菌斑,经PCR扩增,电泳检测所构建cDNA文库的质量。结果:未扩增文库滴度为2.03×106pfu/ml,重组率为98.4%,文库扩增后滴度达2.503×109pfu/ml,重组率为97.6%。插入片段长度分布于500~3 000 bp之间。结论:成功地构建了高质量的高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。     

白纹伊蚊T7噬茵体展示cDNA文库的构建

为筛选白纹伊蚊与相关蚊媒病毒相互作用的基因,本文构建了白纹伊蚊Aedes albopictusT7噬菌体展示eDNA文库,分离与纯化白纹伊蚊mRNA,所得mRNA经反转录合成双链cDNA后,在双链cDNA末端加上定向EcoRI／HindIn接头使其两端分别带EcoRI和Hind11I黏性末端;接着用MiniColumn纯化收集300bp以上的双链cDNA片段连接于T7 Select 10—3b载体;经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建1v7噬菌体展示cDNA文库。所建文库的库容量经测定为1．7×10’pfu／mL,扩增后文库滴度为2．5×10^（15）pfu／mL。对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为95％以上;阳性克隆片段长度分布在200～2000bp,其中有90％的插入片段大于300bp。本文所构建的白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库,满足cDNA文库的基本要求,可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊病毒相互作用的基因。     

藏羚羊大脑皮质cDNA文库的构建

目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量。方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oli-gotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART技术,使用含有SfiIB酶切位点的oligo(dT)引物和含有SfiIA酶切位点的SMARTIV寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA5′末端的模板转换方法合成cDNA第1链。利用LDPCR扩增cDNA,经SfiI(ⅠA和ⅠB)酶切后,通过CHROMASPIN-400柱进行分级分离去除<500bp的片段,再同经SfiI酶切的λTripIEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小。结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109pfu/L,重组率>98%,文库扩增后滴度达8×1012pfu/L,插入片段长度在750～6000bp之间,平均长度为4250bp。结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建类风湿关节炎(RA)滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定RA特异性基因的研究奠定基础。方法取确诊RA患者的滑膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,Oligotex离心柱分离mRNA,电泳检测其质量,逆转录合成双链cDNA,经末端修平、接头连接、酶切后去除过多接头,收集>300bp的cDNA片段,与T7Select10-3载体连接,体外包装并扩增得到类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库。最后,通过铺平板滴度测定及PCR技术鉴定文库质量。结果所构建原始文库重组克隆数为2×107pfu,扩增滴度8.9×1010pfu/ml。PCR法检测片段插入率为90%,插入片段在300～2000bp之间。文库噬菌体裂解液PCR扩增得到BiP基因片段。结论成功构建了高质量的RA滑膜T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步RA自身抗原的筛选奠定了基础。     

藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的初建

利用Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化10h卵囊提取总RNA。利用poly(A)QuikmRNAIsolationkit分离纯化了mRNA。采用cDNASynthesisKit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建了cDNA表达文库,经蓝白斑筛选,其重组率为98%,滴度为0·9×106pfu/mL,扩增后滴度为1×109pfu/mL。随机取10个克隆,提取λDNA后,经PCR鉴定,插入片段长度大于0·4Kb。该cDNA表达文库的构建为下一步功能基因的筛选等奠定了良好基础。     

人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析

目的: 各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因,样本来源有限和不可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质,为探明瓣膜病变的分子机制提供直接证据。方法: 心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织,提取高质量RNA,用SMART技术合成cDNA第1链,再用长距离PCR合成双链cDNA,经 Sfi I酶切后过柱分级收集长片段cDNA,经T4 DNA连接酶催化连接入λTriplEx2载体,最后经λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。 结果: 成功构建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,原始文库滴度为8× 10⁹ pfu/L,重组率为99%,外源基因片段大小在500到3 000 bp之间,其中81.25%片段大于1 000 bp。 结论: 成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性,高重组率能保障功能筛选的高效性,长片段更有助于全长基因的获得和表达。     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定.方法 将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后,以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo(dT)为引物反转录后连接attB衔接子(attB Adapter),层析柱纯化,通过BP重组反应将500 bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONRTM222载体,电转化入ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells,构建Gateway入门cDNA文库,并完全随机挑取单菌落,提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小.构建Gateway目的 载体,通过LR重组反应将入门文库转入此目的 载体成为酵母表达文库,挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小.结果 经鉴定,入门文库平均滴度为(6.80±0.10)×105 cfu/ml,文库总容量为7.48×106 cfu,平均插入片段为(2.20±0.20)kb,重组率为100%.酵母表达文库平均滴度为(3.24±0.10)×106 cfu/ml,文库总容量为3.89×107 cfu,平均插入的片段为(2.27±0.15)kb,重组率为95.83%(23/24).结论 构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求,可用于进一步的研究.     

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库。方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coliTG1,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率。使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库。以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体。结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体。     

云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株cDNA文库构建和鉴定

目的 :构建云南个旧肺鳞癌YTMLC 90细胞株的cDNA文库。方法 :从培养的人肺鳞癌YTMLC 90细胞株中提取总RNA ,利用经修饰的oligo(dT)引物 (含SfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第1链。同时 ,根据真核生物mRNA 5′端帽子结构的特点 ,利用SMART核苷酸 (含SfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第 1链在mR NA 5′端延伸出去的模板。以此序列为引物 ,利用LD PCR(long distancePCR)合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经SfiⅠ酶切的载体λTripIE× 2 ,经体外包装即为cDNA文库。结果 :人肺癌细胞株YTMLC 90的cDNA文库中 ,含有 1.0 1× 10 9pfu/L个重组子 ,重组率为 93.2 %。将该文库扩增后 ,克隆数可达 5 .2 4× 10 12 pfu/L ,插入cDNA的长度为 75 0～ 30 0 0bp。结论 :所构建的cDNA文库具有较好的质量 ,为进一步筛选、克隆肺癌特异性表达基因奠定了基础。     

金仓鼠神经管cDNA文库的建立

目的　构建金仓鼠神经管cDNA文库,以筛选与神经管发育及神经管畸形发生相关的基因。　方法 　用TRIZOLReagent提取金仓鼠神经管总RNA;用LD PCR法反转录合成双链cDNA;经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、 CHROMASPIN 400柱分离去除小于500bp的片段;将cDNA与载体λTriplEX2按一定比例连接;经体外包装,建立 cDNA的噬菌体表达文库。　结果　cDNA文库容量为1.5×106pfu ml,重组率为99%,平均插入片段大于1kb。　 结论　我们初步构建的金仓鼠神经管cDNA文库为高效的cDNA文库。     

米尔比霉素肟化物ScFv噬菌体展示抗体库的构建

目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片段(ScFv)。将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化感受态大肠杆菌,辅助噬菌体超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。结果RT-PCR扩增出长360bp左右的抗体重链可变区基因(VH)及340bp左右的轻链可变区基因(VL),SOE-PCR扩增得到750bp左右的ScFv基因片段,成功构建了库容量为2.4×106,滴度为2.0×1012pfu/mL的噬菌体单链抗体库。结论构建的抗体库目的片段连接率较高,多样性较好,为下一步16元大环内酯类小分子物质高特异性抗体的筛选奠了基础。     

噬菌体展示抗体微型文库的构建

用噬菌体展示技术构建抗神经钙粘连素（N-cadherin，N-cad）分子胞外结构域、CD34分子胞外结构域及AC133分子的噬菌体展示单链抗体库。将3种分子分别表达于噬菌体表面，再以此噬菌体免疫BALB／c小鼠，提取脾总RNA，RT—PCR扩增抗体重、轻链基因cDNA并插入噬菌体表达载体，构建分别抗N-cad分子胞外结构域、CD34分子胞外结构域及AC133分子的噬菌体表达文库。然后对文库的库容量、多样性、滴度及表达能力进行鉴定。结果显示，用噬菌体展示的3种分子免疫小鼠获得成功，所构建抗体文库的库容量、多样性、滴度及表达能力均能满足进一步筛选目的抗体基因的需要，为制备相应的特异性抗体奠定了基础。     

广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建及其表达模式与成虫表达模式的EST分析

从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫,提取其总RNA ,运用“SMARTcDNA文库构建试剂盒”构建其cDNA文库。分别将成虫和幼虫cDNA文库中的噬菌体克隆转化成噬菌粒,用5′端测序引物进行测序。利用BLAST程序对获取的EST从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索。结果显示:所建文库的初始滴度为2 19×10 .6 pfu mL ,经1次扩增后的滴度为1. 0×10 1 0 pfu mL ,插入子的平均长度为1. 2kb ,重组率为97 .3%。从成虫的cDNA文库中得到6 4个EST ,其中有意义的EST有5 4个,占82 . 8% ;无意义的EST有10个,占17. 2 %。6 4个成虫EST序列中,rRNA基因4 9个,占总EST数的76 6 %。从幼虫的cDNA文库中共得到10 6个EST ,其中有意义的EST有91个,占85 . 8% ;无意义的EST有15个,占14 . 2 %。10 6个幼虫EST序列中rRNA基因78个,占总EST数的73. 6 %。本研究首次成功构建了广州管圆线虫幼虫的cDNA文库,EST分析显示广州管圆线虫幼虫和成虫基因表达谱中rRNA基因均占大多数。     

RPL30基因的克隆及其与神经管发育相关关系的研究

本文通过构建金黄地鼠神经管cDNA文库,筛选了RPL30基因,并探讨了其与神经管发育的关系。提取胚胎(E)8.5d的金黄地鼠神经管总RNA,用SMART技术构建神经管cDNA的噬菌体表达文库。利用分部分排除技术(SSS法),结合PCR法逐级筛选cDNA文库。将得到的RPL30阳性噬菌斑进行质粒转化、酶切鉴定及测序分析,进而回收、纯化RPL30cDNA片段并制备探针。用Northern杂交技术检测神经管发育过程中RPL30mRNA的表达状况。结果显示,构建的神经管cDNA文库容量为1.5×106pfu/ml,重组率达到99%,平均插入片段长度大于1kb。经过筛选得到含RPL30cDNA的阳性克隆。序列测定及同源性分析发现,该cDNA片段全长535bp,其中含有完整的开放阅读框。Northern杂交结果显示,在E8d~E12d各时间段,神经管中RPL30mRNA的表达均处于较高水平,且随着时间的增长,表达量递增,于E12d达到高峰。本文结果表明,我们用SSS技术结合PCR法从神经管cDNA文库中克隆到了RPL30基因的全长cDNA序列,该基因可能与神经管发育密切相关。