醋甘遂不同提取物对斑马鱼幼鱼的毒性

目的:研究非致死剂量醋甘遂对斑马鱼幼鱼的毒性及毒性可逆性,并验证斑马鱼模型用于中药毒性快速评价的可行性。方法:用索氏提取器以不同极性溶剂依次提取样品,制备不同提取物。将健康斑马鱼成鱼配对产卵,以正常发育受精后3 d的斑马鱼幼鱼为模型,用醋甘遂不同极性提取物处理斑马鱼幼鱼,统计给药72 h死亡率,对毒性最强的提取部位观察评价其对斑马鱼心血管系统、肝脏、神经系统、胃肠道系统、肾脏及其他脏器系统的毒性特征及可逆性。结果:醋甘遂不同溶剂提取物毒性顺序依次为石油醚提取物二氯甲烷提取物乙酸乙酯提取物乙醇提取物,与空白组比较,石油醚提取部位处理后的幼鱼给药组肝区相对光强度随给药浓度的升高而降低,肝脏颜色变暗(P0.01);肝脏经苏木精-伊红染色后,在石油醚提取部位0.054 mg·L~(-1)给药组中有轻微的肝损伤,在恢复组中肝损伤明显好转。与空白组和石油醚提取部位0.004 mg·L~(-1)组比较,肠道尼罗红排泄实验显示残留率在石油醚提取部位0.012,0.036,0.054 mg·L~(-1)组中显著下降(P0.01),胃肠道被促进排空。其他系统毒性特征不明显,差异均无统计学意义。结论:醋甘遂的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇提取物中,石油醚提取物毒性最大,且主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性,肝毒性造成肝变性,具有可逆性。斑马鱼模型快速评价中药毒性具有较好的应用前景。     

京大戟醋制前后对斑马鱼胚胎肝、胃肠毒性的影响

为研究京大戟醋制前后不同极性部位对斑马鱼胚胎肝、胃肠毒性的影响,实验以95%乙醇提取生、醋京大戟,经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取得不同极性部位。将受精后12 h (12 hpf)的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的溶液中持续至受精96 h (96 hpf),对斑马鱼胚胎的肝、胃肠进行毒性观察。结果显示,毒性随着样品浓度的增加而增强。京大戟醋制前后各极性部位对斑马鱼胚胎的肝、胃肠毒性主要表现为肝脏发育缓慢、肝面积变小、肝脏变性发黑、卵黄囊水肿、吸收延迟、出血、胃肠道蠕动减缓、胃肠道杯状细胞分泌功能异常等,醋制后毒性反应降低。其中石油醚和二氯甲烷部位肝、胃肠毒性作用较为明显,乙酸乙酯部位毒性较弱。以上结果说明,京大戟醋制后毒性降低,且石油醚、二氯甲烷部位是其产生肝、胃肠毒性的主要部位。     

基于斑马鱼幼鱼模型药物肝毒性快速评价方法的优化及评价标准初探

目的 以对乙酰氨基酚(APAP)为例，通过优化其对斑马鱼幼鱼肝毒性评价的影响因素和参数，确立基于斑马鱼幼鱼模型的肝毒性快速评价方法及药物肝损伤分级方法。方法 利用不同浓度APAP处理斑马鱼幼鱼，在实验终点(药物暴露后48 h/24 h)统计不同处理组斑马鱼的死亡率，并绘制“死亡率—浓度”效应曲线，计算最大耐受浓度(LC₀)和半数致死浓度(LC₅₀);考察并优化斑马鱼幼鱼在APAP毒性研究中的相关影响因素，包括斑马鱼鱼龄[3 dpf、4 dpf(受精后天数：dpf)]、给药暴露时间(48 h、24 h)和孔板(6孔板、12孔板；6 mL、4 mL),并从以上3个水平设计正交实验，建立斑马鱼肝毒性模型的最佳实验条件参数。另择3 dpf斑马鱼幼鱼[3 dpf-48 hpe-12孔板(暴露后小时：hpe))]与选定条件(4 dpf-24 hpe-12孔板)进行比较，以表型评价、组织病理学评价、体内凋亡评价、生化指标及肝脏区域面积作为系统生物学评价指标，确认斑马鱼整体肝毒性评价的方法和损伤参照标准。结果 以实验所得各组LC₅₀为指...     

京大戟醋制前后对斑马鱼胚胎的急性毒性研究

采用模式生物斑马鱼的胚胎评价京大戟醋制前后各提取物急性毒性,同时以大戟二烯醇为对照品测定了各提取物的总萜含量。选取24 h发育正常的斑马鱼胚胎,每个提取物设8个浓度和一个空白对照组,并观察给药后96 h斑马鱼胚胎的发育和死亡情况,计算不同样品对斑马鱼胚胎的半数致死浓度(LC_(50))。结果显示对于斑马鱼胚胎,京大戟醋制前后各提取物均有急性毒性,与生品相比,醋制后毒性显著降低。不同提取方式中,醇提物毒性大于水提物;不同极性部位中毒性大小依次为石油醚二氯甲烷乙酸乙酯正丁醇、剩余部位。结合萜类成分含量测定结果可推测萜类成分为京大戟主要毒性成分,且其毒性大小与萜类成分的含量呈正相关。表明斑马鱼胚胎模型适用于京大戟毒性评价,为进一步认识与评价京大戟的毒性成分及醋制减毒的作用机制提供合适的研究方法以及理论依据。     

山豆根黄酮类成分对斑马鱼的急性毒性研究

目的利用体外细胞毒模型结合模式生物斑马鱼急性毒性模型,筛选和评价山豆根提取物、组分及重要单体成分的细胞毒性及对斑马鱼的急性毒性,以期发现山豆根潜在的毒性成分。方法考察山豆根提取物、组分及主要单体成分对人心肌细胞AC16、人正常肝细胞L-02、人肾小管上皮细胞HK-2和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的毒性,筛选山豆根中具有较强细胞毒性的组分及主要单体成分,评价其对模式生物斑马鱼的急性毒性,计算斑马鱼的最大非致死浓度(maximun non-lethal concentration,MNLC)、10%致死浓度(10%lethal concentration,LC10)和半数致死浓度(half lethal concentration,LC50)。给予山豆根酮(1/9MNLC、1/3MNLC、MNLC、LC10)进行干预,观察斑马鱼器官形态学结构的畸形变化、运动情况的异常变化和死亡数量等毒性表型,计算畸形变化率,并考察斑马鱼肝脏组织病理变化。结果山豆根酮对AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y4细胞均具有较强的细胞毒性;在斑马鱼急性毒性模型中,山豆根酮组斑马鱼毒性明显,主要表现为肝毒性、神经毒性、心血管毒性、肾毒性等,其中肝毒性在各剂量下均表现明显,且肝脏组织病理切片显示山豆根酮可诱发斑马鱼肝脏损伤,表明肝脏可能为山豆根酮的主要毒性靶器官。结论山豆根酮为山豆根潜在的毒性成分之一。     

基于斑马鱼模型研究闹羊花肝损效应及其作用机制

采用斑马鱼幼鱼模型探讨闹羊花对肝脏的毒性作用，根据闹羊花不同浓度暴露处理下受精后4 d斑马鱼幼鱼的存活数计算死亡率，并拟合其量毒曲线初步评估闹羊花的毒性大小，从而通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法和吖啶橙(aeridine orange, AO)染色法对比观察闹羊花提取物亚致死浓度处理组和阴性对照组的肝脏表型，并测定对比不同处理组谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的活性以确认闹羊花的肝脏毒性，进一步采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)及蛋白质印迹法检测斑马鱼幼鱼体内基因及蛋白的表达水平，并通过气相色谱时间飞行质谱联用(GC-TOF-MS)进行非靶向代谢组学检测，以探讨其作用机制。结果显示，闹羊花对斑马鱼幼鱼的毒性大小呈剂量依赖性，全部致死浓度为1 100μg·mL^-1,亚致死浓度为448μg·mL^-1<...     

姜黄素对斑马鱼胚胎及幼鱼急性毒性的研究

目的:探讨姜黄素对斑马鱼胚胎和幼鱼的急性毒性,为确定姜黄素对斑马鱼疾病模型的安全剂量提供依据。方法:镜下选用受精后3 h(3 hpf)及受精后5天(5 dpf)的斑马鱼胚胎及幼鱼,分别暴露在不同浓度梯度的姜黄素溶液及空白对照(养殖水)和溶剂对照[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]中,观察暴露24 h、48 h、72 h、96 h胚胎及幼鱼的死亡率、畸形率、畸形形态以及胚胎的孵化率,计算半数致死浓度(LC50)、半数致畸浓度(EC50)、致畸指数(TI)。结果:斑马鱼死亡率、孵化率及畸形率呈浓度相关性,4μmol·L~(-1)组胚胎和幼鱼无死亡,但胚胎出现畸形,幼鱼无畸形,1.86μmol·L~(-1)浓度组胚胎无畸形出现;畸形的种类主要是卵黄囊肿大、心包水肿、血液黏滞、尾部溶解、尾部及脊柱弯曲、鱼鳍缺失、眼未发育;胚胎及幼鱼96 h的LC50值、EC50值及TI值分别为17.70μmol·L~(-1)、17.40μmol·L~(-1)、1.02和7.80μmol·L~(-1)、7.37μmol·L~(-1)、1.06。结论:姜黄素对斑马鱼胚胎及幼鱼有一定的急性毒性及致畸作用,作用于胚胎和幼鱼的最大安全浓度分别为1.86、4μmol·L~(-1)。     

大鼠口给益母草石油醚提取物的毒性研究

 目的考察益母草石油醚提取物对大鼠肝、肾的毒性影响。方法取益母草石油醚提取物按60g·kg^-1·d^-1剂量给大鼠连续灌胃15d,给药结束,留取部分大鼠的血、尿和肝、肾组织标本,检测相关肝、肾功能指标,观察肝、肾形态组织学变化;余下大鼠于停药后15d复测上述指标。实验另设益母草给药组相比较。结果益母草石油醚提取物连续用药15d,血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿蛋白(Upro)、尿N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)指标水平明显升高,肝、肾组织可见肿胀、少量炎细胞浸润等病理损伤;停药后尿蛋白水平升高,其余肝肾功能指标水平均降低,组织病理损伤有所减轻。益母草石油醚提取物对大鼠的肝肾损伤明显比益母草严重。结论益母草石油醚提取物具有明显的肝肾毒性,对Upro水平的影响短期内不可逆,其余毒性影响均具有一定可逆性。益母草致毒性的成分可能主要存在于其石油醚提取物中。     

基于斑马鱼模型进行马兜铃酸心血管毒性的评价

目的:利用斑马鱼模型对马兜铃酸进行心血管毒性的评价。方法:设置4个不同浓度的马兜铃酸溶液,同时设置空白对照组(养鱼水处理组)和溶剂对照组(0.1%DMSO)处理一定阶段的野生型AB系斑马鱼幼鱼至实验终点,每个浓度处理30尾斑马鱼。待测药物处理斑马鱼4 h后,随机选择10尾斑马鱼对心率进行计数。待测药物处理至实验终点时,在立体解剖显微镜下观察有无心包水肿、血流速度变化、血栓及出血等,计算各表型发生率。另设置4个不同浓度的马兜铃酸溶液,并分别设置空白对照组(养鱼水处理组)和溶剂对照组(0.9%Na Cl注射液)处理组,至实验终点每个浓度收集100尾斑马鱼(-80℃贮存),提取mRNA反转成c DNA样本后,进行荧光定量RT-PCR检测斑马鱼组织中MicroRNA146a的表达。结果:当马兜铃酸浓度≥MNLC/3时,可诱发斑马鱼心血管毒性,并呈现浓度相关性增加,表现为血流变慢或(和)缺失、静脉窦处瘀血、静脉窦处水肿和心率变慢(仅LC10处理组),未见心律不齐。荧光定量RT-PCR结果显示,马兜铃酸的4个浓度MNLC10、MNLC/3、MNLC、LC10均显著提高MicroRNA146a的表达(与对照组比较P0.01),且存在一定的浓度关系。结论:马兜铃酸具有一定的心血管毒性作用,且具有浓度相关性。     

基于斑马鱼模型的吴茱萸提取物肝毒性评价

目的 基于斑马鱼模型,通过生化指标、病理组织学、体内细胞凋亡检测和分子生物学技术整合评价模式对吴茱萸提取物肝毒性进行综合评价.方法 给予亚致死剂量(＜LC10)下的吴茱萸提取物24 h,测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartic aminotr...     

不同方法炮制甘遂对LO2细胞周期与凋亡的影响

目的:探讨不同方法炮制所得甘遂各样品对人正常肝细胞LO2细胞周期与凋亡的影响.方法:以人正常肝细胞LO2为研究对象,采用MTT法检测甘遂醋制前后各炮制品(生品、清炒品、酷润品、醋制品)对LO2细胞活性的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态,采用流式细胞术研究甘遂醋制前后各炮制品对LO2细胞周期和凋亡的影响.结果:与阴性对照组比较,甘遂生品可明显降低LO2细胞的活性(P＜0.01)和形态,显著升高S期细胞百分率(P＜0.05),显著降低G2/M期细胞百分率(P＜0.01),显著增加人正常肝细胞LO2细胞的早期凋亡率、晚期凋亡坏死率、总凋亡率(P＜0.01);与甘遂生品组比较,甘遂各炮制品均能降低对人正常肝细胞L02的增殖抑制作用(P＜0.01)和形态变差的趋势,其降低增殖抑制作用的顺序为醋制品＞醋润品＞清炒品,且呈一定的量-效关系(r醋制=0.999,r醋润=0.913,r清炒=0.914,r生品=0.984);且均能显著增加G2/M期细胞百分率(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01),显著减少人正常肝细胞LO2的早期凋亡率、晚期凋亡坏死率、总凋亡率(P＜0.01),其增加G2/M期细胞百分率的顺序和降低凋亡率的顺序均为醋制品＞醋润品＞清炒品.结论:甘遂炮制后可通过影响LO2细胞周期与凋亡降低其毒性,且甘遂醋制工艺中的炒与醋润2种操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能够起到协同作用,从而为揭示上述2种操作在甘遂醋制减毒工艺中的合理性和醋制工艺优化提供了一定的依据.     

醋甘遂活性部位各成分群对斑马鱼胚胎的急性毒性比较研究

采用模式生物斑马鱼的胚胎评价醋甘遂活性部位各成分群急性毒性,同时采用UFLC-Q-TOF-MS对各成分群的化学成分进行定性研究。以24 h健康斑马鱼胚胎为研究对象,各成分群设9个浓度和1个空白对照组,考察给药后96 h其对斑马鱼胚胎存活率的影响,计算不同样品对斑马鱼胚胎的半数致死浓度(LC_(50))。结果显示,各成分群对斑马鱼胚胎的急性毒性大小依次为BCAD,成分群D的毒性不明显。UFLC-Q-TOF-MS分析结果显示成分群B主要检测到巨大戟烷型二萜类成分,成分群C主要检测到假白榄烷型二萜类成分。关联毒性研究结果,推测假白榄烷型二萜类成分可能为醋甘遂中更为低毒的活性成分,可为进一步深入探究醋甘遂"有故无殒"的物质基础提供依据。     

甘遂醋炙对正常及癌性腹水模型大鼠毒性的影响

目的:考察甘遂醋炙前后对正常及癌性腹水模型大鼠毒性的差异。方法:以正常及癌性腹水模型大鼠为研究对象,分组后连续7 d灌胃生、醋甘遂粉末及其提取物,各给药组按0.34 mg·g-1灌胃,空白组与模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠。考察给药后对大鼠肝、胃、肠组织病理形态学、血清肝功能指标、氧化损伤指标的影响。结果:与空白组比较,各正常给药组大鼠肝、胃、肠组织均出现显著损伤,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)活力显著升高,谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量显著降低,丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)含量显著升高;其中生甘遂粉末作用最为显著,醋甘遂该作用显著降低。与模型组比较,各模型给药组大鼠组织损伤有所减轻,血清AST,ALT,ALP活力显著降低,GSH和SOD含量显著升高,MDA和LDH含量显著降低;其中模型生、醋粉组功效最为显著,且两组间无显著性差异。结论:甘遂醋炙后对正常动物的毒性较生甘遂低;在模型动物上,生、醋甘遂均可显著缓解模型的损伤。     

甘遂-甘草配伍对大鼠肾脏毒性代谢组学的影响

目的:根据传统用药习惯,从代谢组学的角度来验证甘遂-甘草以1∶4比例配比时对大鼠肾脏的减毒作用,并在此基础上初步探讨其减毒作用机制。方法:实验采用SD雄性大鼠,随机分为空白对照组,甘遂组,甘草组和甘遂-甘草1∶4组。应用核磁共振技术(NMR)和正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法分析给予大鼠甘遂、甘草和甘遂-甘草1∶4配比液后的大鼠肾脏代谢物变化,并结合血浆生化分析和肾脏组织病理切片HE染色检测,明确甘遂-甘草1∶4配伍的减毒作用机制。结果:甘草组极少引起血浆生化指标和病理学改变,同时对大鼠肾脏内源性代谢物的变化不大;甘遂组能引起血浆葡萄糖的升高和肌酸、肌酐的下降,造成肾小管上皮细胞水肿和空泡变性,肾小球个别出现瘀血的现象,同时引起肾脏内源性代谢物如胆碱,磷酸胆碱,苯丙氨酸,谷氨酰胺的减少和异亮氨酸,亮氨酸,缬氨酸,丙氨酸,乙酸,肌酸/肌酐的增加;而甘遂-甘草1∶4组并未出现明显的血浆生化指标改变,仅出现肾小球轻微瘀血及肾小管上皮细胞扩张的现象,同时仅引起胆碱,磷酸胆碱和苯丙氨酸的减少。结论:甘遂-甘草以1∶4配伍存在明显的减毒作用,主要是通过甘遂毒性生物标志物含量的变化和肾脏毒性传统指标的下调来体现其减毒效应。     

重楼皂苷I对斑马鱼发育毒性、抗血管新生活性及其机制研究

目的 基于模式生物斑马鱼研究重楼皂苷Ⅰ的发育毒性、抗血管新生活性，并利用网络药理学探究重楼皂苷Ⅰ抗血管新生的作用机制。方法 将受精后6 h(6 h post fertilization,6 hpf)的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的重楼皂苷Ⅰ中96 h，在实验终点确认重楼皂苷Ⅰ对斑马鱼胚胎的致死曲线，计算20%致死浓度（20%lethal concentration,LC20）。在实验终点，以斑马鱼自主抽动次数、96 hpf心率、斑马鱼肝脏面积、静脉窦-动脉球间距、总胆固醇（total cholesterol,T-CHO）、三酰甘油（triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）含量等指标，结合吖啶橙、油红O染色观察综合评价重楼皂苷Ⅰ的发育毒性及其相关靶器官毒性。安全剂量条件下，以斑马鱼肝脏面积和静脉窦-动脉球间距评价重楼皂苷Ⅰ对相关靶器官的影响，同时以节间血管数评价重楼皂苷Ⅰ对斑马鱼节间血管生长的影响。基于网络药理学预测重楼皂苷Ⅰ抗血管新生的作用机制并通过qRT-PCR技术进行验证。结果 重楼皂苷Ⅰ...     

基于斑马鱼模型的补骨脂不同炮制品水提物急性毒性及肝毒性差异比较

目的 根据历代医籍和本草记载的炮制方法,对比补骨脂Psoraleae Fructus不同炮制品水提物的急性毒性和肝毒性差异,为补骨脂的炮制方法使用提供参考。方法 采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱和标准曲线法对补骨脂生品和补骨脂不同炮制品水提物进行补骨脂素和异补骨脂素的含量测定,并以AB野生型斑马鱼、Tg(lfabp:EGFP)肝脏细胞绿色荧光标记转基因斑马鱼和Tg(lysc:DsRed2)中性粒细胞红色荧光标记转基因斑马鱼为实验动物模型,给予补骨脂生品和补骨脂不同炮制品的水提物通过观察补骨脂不同炮制品对斑马鱼的半数致死浓度（median lethal concentration,LC50）、最小致死浓度（minimum lethal concentration,LC1）、斑马鱼形态变化、畸形评分等的影响,比较补骨脂不同炮制品的急性毒性差异。通过观察不同给药组对斑马鱼肝脏荧光强度、肝脏面积和体积、肝脏病理切片情况、肝脏区域中性粒细胞数量的影响,以及检测炎症相关基因的m RNA水平变化情况,综合评价补骨脂不同炮制品的肝毒性差异。结果 补骨脂不同炮制品水提物中补骨脂素和异补骨脂素含量存...