下颌骨髁突软骨细胞传代过程中生物学特性变化

目的:观察体外培养及传代对人髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法:采用体外细胞培养、免疫生化及分子生物学方法观察传代过程中人髁突软骨细胞形态、型胶原及蛋白多糖合成及、、型前胶原的mRNA水平变化。结果:传代过程中人髁突软骨细胞型胶原合成及其mRNA水平逐渐降低,至第7代已基本丧失。而、型胶原的mRNA水平随传代逐渐升高,同时伴有细胞蛋白多糖合成的减少,细胞壁形态由圆形或多角形转变为长梭形占优势。结论:体外培养及反复传代可影响软骨细胞的表型特征。髁突软骨细胞的反分化标准应从胶原、蛋白多糖合成及细胞形态等方面综合评价     

生长期兔髁突软骨细胞体外培养方法及其生物学特性研究

目的 建立髁突软骨细胞体外培养模型,研究其生物学特性。 方法 分离4周龄健康新西兰大白兔双侧髁突软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化方法收集4 h和12 h 2个时间点的髁突软骨细胞,连续体外培养并传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用甲苯胺蓝、阿利新蓝和免疫细胞化学染色对髁突软骨细胞进行鉴定;利用细胞计数绘制细胞生长曲线;通过Western 免疫印迹分析细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9在蛋白水平的表达情况。采用SPSS13.0软件包对Western 印迹条带灰度值进行统计学分析。 结果 兔髁突软骨细胞体积较大,呈纺锤形或多角形,铺路石样排列,细胞爬片染色结果为阳性。随着细胞传代“成纤维样”细胞比例逐渐加重,P2代之前的细胞形态差异较小。细胞生长曲线显示,兔髁突软骨细胞的体外培养符合经典的S形生长曲线。Western 印迹结果表明,4h和12 h所收髁突软骨细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9表达无显著差异。 结论 使用本方法培养兔髁突软骨细胞简单有效。髁突软骨细胞体外培养存在去分化现象,但P2代以内的髁突软骨细胞生物学特性相对稳定,适合用于后期实验研究,P3代以后的髁突软骨细胞逐渐丧失原有细胞的特性。     

细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究

目的 研究细胞冻存处理对髁突软骨细胞去分化特性的影响。方法 分离并体外培养2周龄新西兰大白兔双侧髁突软骨细胞, 将P1代冻存处理15 d后传代培养。采用倒置相差显微镜观察比较正常传代培养的P2代髁突软骨细胞（对照组）和经冻存处理后传代的P2代髁突软骨细胞（实验组）间的细胞形态;通过荧光定量PCR和Western免疫印迹技术检测和分析两组间软骨细胞标志物COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的表达差异,并使用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置相差显微镜观察发现实验组P2代髁突软骨细胞会出现一定程度的形态学改变;但是并未发现实验组和对照组之间COL2、COL10、Sox9和Aggrecan的表达有统计学意义的差异;实验组和对照组软骨标志基因的表达均会较P1代出现降低。 结论 体外培养髁突软骨细胞存在去分化现象,但细胞冻存处理并不会加速其去分化进程,所以体外培养的髁突软骨细胞可以通过冻存技术来实现髁突软骨细胞的暂存。     

人胚髁状突软骨细胞的分离,培养和生物学性态

目的：研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性。方法：体外培养人胚髁状突软骨细胞，观察其从原代至第６代的形态变化；测定细胞数量的变化及其生长曲线；测定冷冻复苏后的细胞存活；观察细胞的超微结构。结果：从原代至第３代，髁状突软骨细胞为圆形、多角形，从第４代开始逐渐转变梭形的成纤维细胞。体外培养至第６天髁状突软骨细胞的数量是接种时的３倍。冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查，发现细胞存活率为９２％。体     

人胚髁状突软骨细胞的分离、培养和生物学性状

目的:研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性.方法:体外培养人胚髁状突软骨细胞,观察其从原代至第6代的形态变化;测定细胞数量的变化及其生长曲线;测定冷冻复苏后的细胞存活;观察细胞的超微结构.结果:从原代至第3代,髁状突软骨细胞为圆形、多角形,从第4代开始逐渐转变为梭形的成纤维细胞.体外培养至第6天髁状突软骨细胞的数量是接种时的3倍.冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查,发现细胞存活率为92%.体外培养髁状突软骨细胞的超微结构正常.结论:单层培养髁状突软骨细胞的表型至少能够保持3代稳定,且形态结构正常,具有正常的生长增殖能力,并可经深低温冷冻长期保存.     

颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞及基质合成代谢特性的研究

目的 探讨颞下颌关节骨关节病(TMJOA)软骨细胞的细胞生物学特性。方法 通过手术切除部分关节盘的方法,制造TMJOA的兔动物模型;从模型动物处于骨关节病病变增殖修复期的髁突软骨组织中获取细胞体外培养,并采用RT-PCR法比较病变软骨细胞与正常对照细胞对软骨基质蛋白、基质胶原酶和内源性生长因子的表达差异。结果 从TMJOA模型的髁突软骨组织中获得细胞经体外培养、鉴定,确认为软骨细胞;骨关节病髁突软骨细胞对软骨基质蛋白的表达不平衡,对内源性基质胶原酶的表达水平和内源性生长因子TGF-β1、IGF-1的表达明显增强。结论 本研究从细胞生物学角度证实了骨关节病早期关节软骨内出现合成代谢活跃的组织学特点,并发现该阶段组织细胞的修复代偿反应可致软骨基质成分合成的不平衡,最终可导致软骨基质环境改变。     

生长期兔髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞生物学特性的比较研究

目的 建立软骨细胞体外培养模型,研究纤维软骨和透明软骨的生物学差异。 方法 分离4周龄雌性兔双侧髁突软骨和膝关节骨骺软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化的方法收集软骨细胞,分别进行体外培养并连续传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色的方法分别对髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞进行鉴定;用细胞计数的方法绘制生长曲线;运用荧光定量PCR和Western印迹技术对软骨特异性指标Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan进行检测,并使用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置显微镜观察示,髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞形态均会随细胞传代而发生改变,且P2代以后改变明显;基因和蛋白水平的检测均证实P2代后软骨细胞去分化明显。阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定结果均为阳性,对照组为阴性。实时定量荧光PCR和Western印迹结果证明：在纤维软骨中,Ⅰ型胶原的表达量高于透明软骨;而Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达量却明显低于透明软骨。 结论 使用本方法培养软骨细胞简单有效;髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞体外培养均存在去分化现象,且两者Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达存在显著差异,生物学特性并不相同。     

髁突骨软骨瘤细胞培养与生物学行为的初步研究

目的:研究体外培养髁突骨软骨瘤细胞的生物学行为。方法:体外培养人髁突骨软骨瘤细胞,应用HE染色观察细胞形态,吉姆萨染色检测其克隆形成能力,阿利新蓝染色、逆转录聚合酶链反应和免疫荧光染色检测其软骨标记物表达。结果:髁突骨软骨瘤细胞能在体外成功培养和传代。细胞呈梭形、星形或多角形,细胞核有核异型性。细胞有较强的克隆形成能力,克隆形成率为16%±1.2%。髁突骨软骨瘤细胞能分泌糖胺聚糖,表达Col2和Sox9。结论:髁突骨软骨瘤细胞具有肿瘤细胞和软骨细胞的双重特性,为研究髁突骨软骨瘤的防治提供了一个细胞模型。     

猕猴耳廓软骨细胞体外不同的培养方式与生长活性

目的:探讨猕猴耳廓软骨细胞在体外不同介质的培养情况及其生长活性.材料与方法:对6只猕猴进行耳廓软骨取材、软骨细胞的分离,并行单层贴壁培养及在人工基质上的培养.通过倒置显微境和扫描电镜观察不同方式培养的细胞生长情况.结果:单层贴壁培养的软骨细胞可传代5～6代,但第三代软骨细胞分泌的Ⅰ型与Ⅱ型胶原的能力无明显差别;在几丁质上培养的软骨细胞能保持体内细胞的正常形态;在VICRYL上培养的软骨细胞能分泌软骨基质.结论:不同的体外培养方式下软骨细胞的生长活性略有不同,需根据不同的实验要求选择相应的培养方式.     

肝细胞生长因子基因转染兔髁状突软骨细胞及对其生物学特性的影响

目的观察携带有绿色荧光蛋白(gree fluorescent protein,GFP)标记的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)cDNA转染兔髁状突软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔髁状突软骨细胞体外培养至第2代,HGFcDNA转染软骨细胞,空白质粒组为对照组;噻唑蓝(MTT)检测软骨细胞的增殖能力,SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果髁状突软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性,并可促进软骨细胞的增殖,SABC免疫组化测第Ⅵ代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性,而对照组软骨细胞则明显减弱,说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31.23%。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔髁状突软骨细胞后可发挥其生物学功能,加速细胞的生长,在荧光显微镜下可直观地计算软骨细胞的瞬间转染率。     

藻酸盐凝胶三维培养体系在TMJ骨关节病髁突软骨细胞体外培养中的应用

目的 将藻酸盐凝胶三维培养体系应用于颞下颌关节骨关节病（osteoarthritis of temporomandibular joint,TMJOA)髁突软骨细胞的体外培养。方法 利用机械与酶消化的方法从TMJOA患者手术切除患疾髁突软骨中获得髁突软骨细胞，部分细胞在二维贴壁培养条件下体外培养1周；部分细胞在高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质，进行三维培养4周；分别对贴壁条件下培养细胞和藻酸盐细胞凝胶微球右蜡包埋切片进行Ⅱ型胶原和软骨特异性蛋白多糖的免疫组化鉴定。结果 从骨关节病髁突软骨组织中收获并行体外培养成活的细菌，鉴定为软骨细胞；体外培养的藻酸盐凝胶三维培养体系中的髁突软骨细胞生长状态良好；培养4周后细胞保持了良好的分化表型。结论 成功地体外培养成活了人TMJOA髁突软骨细胞；成功地将藻酸盐凝胶三维培养体系应用于人TMJOA髁突软骨细胞体外培养，在该体系中，软骨细胞生长状态与功能蛋白分泌能力良好。     

Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0～2 h内逐渐升高,在2～4 h内却逐渐降低;PTHrP在0～2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2～4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

不同静压力下髁突软骨细胞MMP-13的表达变化研究

目的:探讨在不同强度及不同时间的静压力作用下,髁突软骨细胞中MMP-13表达的变化及意义。方法 :体外分离培养SD大鼠髁突软骨细胞,用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定;分别用0、50、100、150、200 k Pa静压力进行2 h的加压处理。另外在200 k Pa静压力下,分别对髁突软骨细胞进行0、1、2、4、8和12 h的加压,采用Western blot免疫印迹及实时荧光定量PCR,分析髁突软骨细胞在不同强度及不同时间的静压力加载后,MMP-13的m RNA和蛋白表达变化。结果 :在50~200 k Pa的静压力范围内,随着压力的增大,MMP-13蛋白及m RNA表达水平均呈下降趋势,实验组表达水平均降至对照组(0 k Pa组)以下,且差异有统计学意义(P<0.05)。在200 k Pa的静压力下,随着加压时间的延长,MMP-13表达呈先上升后下降的趋势,且4 h实验组达最高水平(P<0.05)。结论:髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有较好的适应能力,压力的改变可能影响颞下颌关节的适应性改建。     

机械压力对大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性影响的体外研究

目的:建立体外培养细胞加力装置,在细胞水平探讨机械力作用下大鼠髁突软骨细胞功能代谢的变化。方法:采用流式细胞术检测不同时段、不同力值的机械压力对体外培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果:在一定时间、0～2.03×10-4Pa(0～207g/cm2)力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性增高,以持续压力作用6h最为明显;当持续压力作用于下颌髁突软骨细胞24h后,细胞增殖活性则出现下降。结论:在一定时间、一定力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性有逐渐增高的趋势;当持续压力作用超过一定的范围,细胞增殖活性则出现下降趋势     

大鼠髁突软骨细胞冻存复苏后的生物学特性观察

目的观察低温冻存1月后,不同年龄大鼠髁突软骨细胞的生物学特性。方法体外培养出生后1天、7天、14天、28天共4组SD大鼠髁突软骨细胞。对冻存复苏后的细胞进行形态学观察;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测其对糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型胶原的合成能力;台盼蓝拒染试验测定细胞成活率;MTT法观察细胞增殖能力;实时定量-聚合酶链式反应(real time-PCR)检测冻存后细胞增殖核抗原(PCNA)基因表达情况。结果低温冻存后,各年龄组大鼠髁突软骨细胞仍能保持软骨细胞特有的形态及特性;细胞成活率均大于90%;生长曲线近似"S"型;冻存后各年龄组细胞pcna基因表达较冻存前无显著统计学差异(P>0.05)。结论低温冻存1月后的大鼠髁突软骨细胞成活率高,并保持了其生物学特性及增殖活性。     

周期性单轴压力对大鼠髁突软骨细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 探讨在髁突软骨细胞受到周期性单轴压力后,结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor, CTGF)表达的影响,为正畸治疗中髁突软骨受力后的改建提供生物学依据。方法 选取1周龄SD大鼠,提取并培养髁突软骨细胞,免疫组化鉴定。利用四点弯曲细胞力学加载仪对第3代细胞进行力值为2000u strain、0.5Hz的体外周期性单轴压力加载,分别在加力0min、30min、60min和120min后继续培养24h,应用蛋白印迹法检测在不同加力时间CTGF蛋白表达的变化。应用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。结果 CTGF的相对蛋白量在加力0min、30min、60min和120min后,分别为0、1.59、2.34和3.16,随着加载时间的增加,表达呈逐渐上升趋势。且组间差异具有统计学意义(P<0.05) 结论 周期性单轴压力可刺激大鼠髁突软骨细胞CTGF的表达。