颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞及基质合成代谢特性的研究

目的 探讨颞下颌关节骨关节病(TMJOA)软骨细胞的细胞生物学特性。方法 通过手术切除部分关节盘的方法,制造TMJOA的兔动物模型;从模型动物处于骨关节病病变增殖修复期的髁突软骨组织中获取细胞体外培养,并采用RT-PCR法比较病变软骨细胞与正常对照细胞对软骨基质蛋白、基质胶原酶和内源性生长因子的表达差异。结果 从TMJOA模型的髁突软骨组织中获得细胞经体外培养、鉴定,确认为软骨细胞;骨关节病髁突软骨细胞对软骨基质蛋白的表达不平衡,对内源性基质胶原酶的表达水平和内源性生长因子TGF-β1、IGF-1的表达明显增强。结论 本研究从细胞生物学角度证实了骨关节病早期关节软骨内出现合成代谢活跃的组织学特点,并发现该阶段组织细胞的修复代偿反应可致软骨基质成分合成的不平衡,最终可导致软骨基质环境改变。     

体外髁突软骨培养方法的建立

目的:建立体外髁突器官培养系统,明确体外培养髁突软骨的生物学特性,为髁突软骨体外实验提供基础。方法:选用新生SD大鼠的髁突软骨作为器官培养材料,采用格栅式器官培养法,建立体外髁突软骨器官培养模型。分别在取材培养后1~6 d收集样本,制备组织切片并观察。结果:培养早期(4 d以内),髁突软骨层次分明,细胞结构完整,形态良好。培养时间延长至5 d,软骨表层局部出现空腔。结论:体外器官培养的髁突软骨在4d内能维持良好的形态和生长状态,具有生物活性,可以应用于髁突软骨的相关体外实验研究。     

生长期兔髁突软骨细胞体外培养方法及其生物学特性研究

目的 建立髁突软骨细胞体外培养模型,研究其生物学特性。 方法 分离4周龄健康新西兰大白兔双侧髁突软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化方法收集4 h和12 h 2个时间点的髁突软骨细胞,连续体外培养并传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用甲苯胺蓝、阿利新蓝和免疫细胞化学染色对髁突软骨细胞进行鉴定;利用细胞计数绘制细胞生长曲线;通过Western 免疫印迹分析细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9在蛋白水平的表达情况。采用SPSS13.0软件包对Western 印迹条带灰度值进行统计学分析。 结果 兔髁突软骨细胞体积较大,呈纺锤形或多角形,铺路石样排列,细胞爬片染色结果为阳性。随着细胞传代“成纤维样”细胞比例逐渐加重,P2代之前的细胞形态差异较小。细胞生长曲线显示,兔髁突软骨细胞的体外培养符合经典的S形生长曲线。Western 印迹结果表明,4h和12 h所收髁突软骨细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9表达无显著差异。 结论 使用本方法培养兔髁突软骨细胞简单有效。髁突软骨细胞体外培养存在去分化现象,但P2代以内的髁突软骨细胞生物学特性相对稳定,适合用于后期实验研究,P3代以后的髁突软骨细胞逐渐丧失原有细胞的特性。     

人胚髁状突软骨细胞的分离,培养和生物学性态

目的：研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性。方法：体外培养人胚髁状突软骨细胞，观察其从原代至第６代的形态变化；测定细胞数量的变化及其生长曲线；测定冷冻复苏后的细胞存活；观察细胞的超微结构。结果：从原代至第３代，髁状突软骨细胞为圆形、多角形，从第４代开始逐渐转变梭形的成纤维细胞。体外培养至第６天髁状突软骨细胞的数量是接种时的３倍。冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查，发现细胞存活率为９２％。体     

体外培养下压力对下颌髁突软骨细胞基质中胶原合成的影响

我们通过观察不同压力条件下体外培养的下颌髁突软骨细胞基质中胶原含量的变化情况，探讨不同压力对软骨细胞体外合成胶原的影响，为寻找软骨组织工程种子细胞体外培养的适宜生物力学条件提供参考。     

人髁突软骨细胞培养及细胞库建立

目的　建立生物学性状稳定的髁突软骨细胞库 ,为颞下颌关节髁突软骨缺损及关节盘的生物性修复奠定基础。方法　髁突软骨取自因母体健康原因需终止妊娠的人胚胎 ,经机械分离及胰蛋白酶、胶原酶联合消化获得 ,应用微载体培养技术进行髁突软骨细胞的体外扩增 ,采用液氮深低温保存细胞 ,并定期 (2周、1个月 )对复苏软骨细胞生物学特性鉴定。结果　微载体培养技术可在短期内获得大量的、高成活率的髁突软骨细胞。经液氮冻存的软骨细胞在细胞增殖动力学、表型特征及细胞代谢方面无显著变化 ,基本上保持了原代培养软骨细胞的生物学特性。结论　成功的建立了髁突软骨细胞库 ,可为应用组织工程技术修复关节软骨缺损及重建关节盘的研究提供良好的供体细胞     

鼠胚髁突外植体无血清培养模型的建立与评价

目的 体外建立髁突软骨外植体无血清培养模型，为研究髁突软骨发育改建及各种因子对髁突软骨作用提供适宜手段。方法 体外解剖分离鼠胚髁突，行外植体培养，通过组织学、免疫组织化学等方法观察髁突外植体在无血清和含血清体外培养系统中的生长和组织分化状况。结果 在无血清培养20天后，髁突软骨膜与软骨层保持紧密结合，尽管部分肥大层软骨排列紊乱，阿辛蓝及Ⅱ、X型胶原染色显示培养软骨组织能形成软骨基质。在含血清的对照组中，软骨组织分化层次过程紊乱，纤维层过度增生并与软骨分离，软骨基质减少，软骨部分降解。结论 此无血清培养髁突外植体模型中髁突软骨能正常发育，髁突软骨细胞增殖与分化与体内状态接近，此培养系统可用来体外研究髁突发育以及各种环境因子对髁突生长、发育、生理改建的影响。     

猕猴耳廊软骨细胞的体外培养与鉴定

目的：掌握猕猴耳办骨细胞的体外分离、培养和鉴定技术，探讨耳廊罗作为软骨细胞供区的可行性。材料与方法：对6只猕猴进行耳廊软骨取材、软骨细胞的分离，并行单层贴壁培养，通过倒置显微镜观察细胞生长情况并行细胞生长曲线的绘制；通过免疫组织化学染色对细胞分泌的基质成分进行鉴定。结果：6只猕猴的耳廊软骨经分离后，获得了高纯度、高活性的软骨细胞，并成功地进行了体外培养；软骨细胞倍增时间为98小时；免疫组织化学染色发现体外培养的软骨细胞具有分泌胶原基质的能力，但第三代细胞分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原的能力无明显区别。结论：利用猕猴耳廊软骨细胞体外分离及培养，有成功地获得具有体内活性的软骨细胞，耳廊软骨是一种易获取的软骨细胞供枢。     

生长期兔髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞生物学特性的比较研究

目的 建立软骨细胞体外培养模型,研究纤维软骨和透明软骨的生物学差异。 方法 分离4周龄雌性兔双侧髁突软骨和膝关节骨骺软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化的方法收集软骨细胞,分别进行体外培养并连续传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色的方法分别对髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞进行鉴定;用细胞计数的方法绘制生长曲线;运用荧光定量PCR和Western印迹技术对软骨特异性指标Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan进行检测,并使用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置显微镜观察示,髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞形态均会随细胞传代而发生改变,且P2代以后改变明显;基因和蛋白水平的检测均证实P2代后软骨细胞去分化明显。阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定结果均为阳性,对照组为阴性。实时定量荧光PCR和Western印迹结果证明：在纤维软骨中,Ⅰ型胶原的表达量高于透明软骨;而Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达量却明显低于透明软骨。 结论 使用本方法培养软骨细胞简单有效;髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞体外培养均存在去分化现象,且两者Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达存在显著差异,生物学特性并不相同。     

ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖及成软骨分化的作用。方法:采用酶消化法提取小鼠髁突软骨细胞并鉴定。体外采用siRNA沉默小鼠髁突软骨细胞中Alk2基因的表达,通过MTT法检测细胞增殖。通过实时定量RT-PCR方法检测软骨细胞标志基因的表达。结果:倒置显微镜观察体外培养的小鼠髁突软骨细胞形态。免疫组化染色显示COLⅠ强阳性,AGGRECAN弱阳性,COLⅡ弱阳性。Pellet培养后实时定量RT-PCR检测发现ColⅡ,ColⅩ和ColⅠ表达上调。证实所分离的细胞是髁突软骨细胞。MTT结果显示Alk2沉默后细胞数量增加,实时定量RT-PCR结果显示Alk2沉默后软骨细胞基因表达下调,并有显著统计学意义。结论:ALK2抑制小鼠髁突软骨细胞的增殖,促进小鼠髁突软骨细胞的成软骨分化。     

Studies on chondrocytes from mandibular condylar cartilage, nasal septal cartilage, and spheno-occipital synchondrosis in culture. I. Morphology, growth, glycosaminoglycan synthesis, and responsiveness to bovine parathyroid hormone (1-34)

Methods for isolating chondrocytes from the craniofacial complex and culturing them in vitro were established. Chondrocytes which were isolated by collagenase digestion from mandibular condylar cartilage, nasal septal cartilage, and spheno-occipital synchondrosis grew well in vitro. All three types of chondrocytes actively synthesized glycosaminoglycans, a differentiated phenotype of chondrocytes, and responded well to parathyroid hormone. However, some different characteristics were noted among the three types of chondrocytes in culture.     

The immunolocalisation of VEGF in the articular cartilage of sheep mandibular condyles.

INTRODUCTION: Vascular endothelial growth factor (VEGF) has recently been found to be essential for hypertrophic chondrocyte apoptosis and angiogenesis at the growth plate of long bones, indicating a central role in endochondral ossification. VEGF has more recently, also been shown to be expressed in articular cartilage chondrocytes in human osteoarthritic and rheumatoarthritic joints but not healthy adult joints. To investigate the role of VEGF in the fibrocartilage of the temporomandibular joint, this study aimed to document the presence and distribution of VEGF in the condylar articular cartilage of sheep temporomandibular joints. METHODS: Mandibular condyles of the temporomandibular joints of five 18-month old Wether sheep were fixed, decalcified, paraffin embedded and sectioned. The sections were analyzed using immunohistochemistry for VEGF. RESULTS: VEGF was found to be localised predominantly to the proliferative and maturing layers of chondrocytes in the condylar fibrocartilage of the temporomandibular joints. Articular cartilage is an avascular and alymphatic tissue. As such, the localisation of VEGF to the articular cartilage of normal temporomandibular joint condyles suggests a role for VEGF other than angiogenesis. CONCLUSION: VEGF is shown here for the first time to be present in mandibular condylar cartilage, leading us to propose a possible role in non-angiogenic extracellular matrix remodeling.     

颞下颌关节髁突软骨细胞体外培养中去分化现象研究

目的　研究去分化髁状突软骨细胞的细胞生物学特性。方法　连续在体外贴壁条件下培养传代正常乳兔髁突软骨细胞至第 2 0代 ,观察培养细胞的形态变化 ,免疫组化法和RT -PCR法对传代过程中的数代细胞对II型胶原与蛋白多糖聚糖体的表达情况进行连续检测 ,观察细胞软骨基质蛋白表达分泌的变化以及发生明显去分化软骨细胞的超微结构特点。结果　在贴壁培养条件下 ,髁状突软骨细胞去分化现象于细胞传代第 3代后逐渐显著 ,第 6代后培养的软骨细胞几乎完全去分化。去分化细胞胞体拉长 ,呈“成纤维细胞”样外观。去分化过程中 ,细胞对软骨基质蛋白的表达水平逐渐降低 ,细胞增殖速度增强。透射电镜观察显示 ,去分化软骨细胞细胞核明显呈分叶状 ,表现出异型核。结论　髁突软骨细胞在体外贴壁培养传代过程中会发生去分化现象 ,丧失软骨细胞特征性细胞表型。     

骨髓基质细胞诱导分化修复髁突软骨面缺失的实验研究

目的:采用骨髓基质细胞(BMSCs)体内修复髁突软骨全层缺失。方法:15只山羊,9只作为实验组,将BMSCs和少量软骨细胞(7:3比例混合)按5×107/mL与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处;对照组6只山羊,髁突软骨全层缺失区植入支架材料,分别于术后4、8、12周每个时间段取材3只实验动物,2只对照组动物;2组分别用HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化法进行评价。结果:实验组术后4周,山羊髁突软骨缺失区能形成成熟的软骨组织,12周时软骨未退变。对照组不能形成成熟的软骨组织。结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊颞下颌关节髁突软骨面全层缺失。     

生长分化因子11对小鼠颞下颌关节骨关节炎髁突软骨细胞脂肪化的影响

目的 观察生长分化因子11(GDF11)对小鼠颞下颌关节(TMJ)骨关节炎(OA)髁突软骨细胞脂肪化的影响.方法 对雌性6周龄C57小鼠施加单侧前牙反(牙合)(UAC)刺激并局部注射GDF11.取TMJ髁突软骨进行番红O染色;GDF11、脂联素(Adiponectin)免疫组织化学染色;实时定量聚合酶链式反应(real...     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

The effect of parathyroid hormone (1-34) on cyclic AMP level, ornithine decarboxylase activity, and glycosaminoglycan synthesis of chondrocytes from mandibular condylar cartilage, nasal septal cartilage, and spheno-occipital synchondrosis in culture

Previously, we reported methods for isolating chondrocytes from the craniofacial complex and their culture in vitro. The response of these chondrocyte cultures to bovine parathyroid hormone (1-34) (PTH) has now been investigated. PTH stimulated glycosaminoglycan (GAG) synthesis, a characteristic of the cartilage phenotype in cultured chondrocytes isolated from mandibular condylar cartilage (MCC), nasal septal cartilage (NSC), and spheno-occipital synchondrosis (SOS). These stimulations of GAG synthesis by PTH were dose-dependent. PTH also increased accumulation of cyclic AMP (cAMP) and the activity of ornithine decarboxylase (ODC), a rate-limiting enzyme in polyamine biosynthesis. However, PTH did not stimulate DNA synthesis. The increases in the cAMP level, ODC activity, and GAG synthesis after addition of PTH (10(-7) mol/L) were greatest in MCC-chondrocytes and least in NSC-chondrocytes. The difference in the responses to PTH of these three types of chondrocytes may reflect differences of the characteristics of these cells in vivo.