基因工程在构建酿酒酵母酒精发酵菌的研究进展

基因工程已广泛地应用于微生物菌种的改造与构建,而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵工业的重要的微生物,乙醇生产重要菌株,也是第1个完成基因组测序的真核生物。目前的能源危机使可再生资源燃料酒精得到广泛应用,利用基因工程对酿酒酵母进行遗传修饰,构建高产乙醇的基因工程菌株已成为目前构建酿酒酵母的发酵菌种的热点。本文综述了基因工程在酿酒酵母酒精发酵改良上的应用和展望。     

发酵罐在基因工程药物生产中的应用

相关基因在工程菌中的表达是前期研究开发的关键;而发酵和提取是生产的关键。发酵罐是培养工程菌的设备同时也是生成基因工程药物的设备,表达效率要靠发酵结果才能体现出来。发酵罐在基因工程药物生产中起着至关重要的作用,是必不可小的关键设备。基因工程药物以组织活性物质为多,治疗所用的剂量并不大,大多是特效药用于特殊病例,所以生产这些药物的发酵罐同抗生素发罐在体积上有着极大的差异。抗生素发酵罐的容积动则数十吨上百吨,而啤酒发酵罐则会更大一些,但基因工程发酵罐往往以较小容积出现,如数十升或数百升。正是因为如此,…     

生物技术在药用真菌资源开发与保护中的应用

生物技术的飞速发展给中医药科学研究带来了革命性的变化，药用真菌是中药的重要组成部分。综述了我国药用真菌资源的现状和开发利用概况；真菌生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等基本内容及其在药用真菌资源开发、利用与保护中的应用。讨论了生物技术在传统药用真菌生产、地道药用真菌培育及选种鉴定、利用基因工程和细胞培养技术高效表达和生产天然活性成分或转基因真菌以及利用基因工程手段提高真菌代谢产物的含量、生物技术在药物筛选等方面的应用前景。     

计算机凝胶图像光密度分析系统在基因工程药物生产中的应用

在医学分子生物学研究的广阔领域里,基因和蛋白质的研究一直有着其主导的研究地位。利用基因工程技术在体外大量生产活性蛋白类药物,是分子生物学研究中生物工程技术领域研究的热点内容。但是,基因工程药物(Recombinant medicines)不同于其它的一般药物,它来源于活的生物体,有着复杂的分子结构及较多的干扰物质。它的生产涉及到生     

全国遗传工程在工业上应用讨论会

1973年,在美国的一次分子生物学学术会议上,出现了基因(DNA)可以人工重新组合并在细菌中繁殖的苗头。后来DNA重组技术迅速发展,一个新兴领域——遗传工程(基因工程)应运而生,并与细胞融合技术、酶的固定化技术等一起,形成了现代生物技术。在以后的短短几年内,基因工程就和传统的生物工艺学,特别是发酵工艺学结合,在许多人们生活密切相关的领域(如医药、食品、农     

基因工程学理论和技术教学经验浅谈

基因工程学是一门新兴的前沿科学,已成为二十一世纪生命科学中一门重要的学科,基因工程技术已渗透到医学、工业、农业等多种生命科学领域。现已利用基因工程的技术对二十多种疾病,七百多个病人进行基因治疗;已使许多疾病的发病机理得以阐明,使临床上不少疾病的诊断和治疗有了长足的进步,基因工程药物的生产和临床应用,不仅推动了医学的发展,而且带动了医药工业的腾飞;转基因植物的成功大大提高了农作物的产量并使我们的世界更加灿烂;克隆羊的出现震惊了全世界。二十一世纪,基因工程将发挥更大的作用。     

分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵研究

目的：优化重组铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因工程菌的发酵条件，实现PEA的高效表达。方法：构建PEA的原核分泌型基因工程菌，利用摇瓶发酵研究PEA工程菌的最优表达条件，并放大至3．75L发酵罐水平。结果：摇瓶发酵的最优培养条件为温度30℃，摇床转速160r／min，在含2g／L葡萄糖的LB培养液中培养至A600≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的异丙基硫基半乳糖(IPTG)诱导表达5h。3．75L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比，发酵周期缩短了约三分之一，PEA表达水平接近摇瓶中发酵水平，目标蛋白表达率达到了26．6％。结论：利用摇瓶最优表达条件，较好地实现了重组PEA从摇瓶到发酵罐的放大。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.     

影响人截短型胰岛素样生长因子-Ⅰ在大肠杆菌中表达的因素

基因工程菌能否高效表达目的基因是基因工程技术成败的关键之一。对影响囊胰岛素样生长因子在大肠杆菌中表达的几个因素,包括宿主一栽体系统的选择、基因拷贝数、诱导温度、诱导物的使用及外加药物利福平对表达的影响等问题加以讨论,着看探讨了双拷贝及利福平对表达的影响。     

影响人截短型胰岛素样生长因子-Ⅰ在大肠杆菌中表达的因素

基因工程菌能否高效表达目的基因是基因工程技术成败的关键之一。对影响囊胰岛素样生长因子在大肠杆菌中表达的几个因素,包括宿主一栽体系统的选择、基因拷贝数、诱导温度、诱导物的使用及外加药物利福平对表达的影响等问题加以讨论,着看探讨了双拷贝及利福平对表达的影响。     

特异性DNA倍增技术检测t-PA cDNA基因在表达细胞中的稳定性

利用特异性DNA倍增技术(polymerase chain Reaction,PCR)检测t-PA cDNA基因在表达细胞基因组中的稳定性,并对所得的PCR反应产物进行了限制性内切酶片段、分子杂交和核苷酸顺序分析等方面的研究,证实了t-PA cDNA基因已插入到表达细胞染色体中。这种方法快速、简便、灵敏度和特异性高,是检测基因工程表达细胞中cDNA基因稳定整合状况的好方法。     

Sorbinil 和Zopolrestat 对酵母工程菌中人醛糖还原酶活性的抑制作用

目的利用人醛糖还原酶基因(AR)及其与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的酵母细胞表达模型,选用两种经典的AR抑制剂(ARI)-Sorbinil和Zopolrestat,初步观察模型在药物筛选方面的功能。方法复苏菌种并培养,在细胞培养液中加入ARI,观察细胞生长、GFP表达及荧光强度、AR蛋白表达及AR活性。结果 GFP荧光表达及AR蛋白的表达不受影响,但AR活性可被Zopolrestat抑制。结论 GFP标记的AR基因的酵母细胞模型可用于ARI的初步筛选,易重复,费用经济。Zopolrestat对酵母工程菌中表达的AR活性呈现出良好的抑制效应,可考虑作为该模型进行ARI筛选时的对照药物。     

对创办医学生物技术专业的考察与思考

21世纪是生命科学的世纪,生物学在整个自然科学的进展中已成为带头学科,其中生物技术在世界范围内的医药、食品、农、林、牧、渔、环保、园林等行业愈来愈多地被广泛的应用,成为推动新世纪现代经济发展必不可少的高新技术的组成部分。生物技术之所以对本世纪的经济发展具有举足轻重的作用,是因为它可以提高人类的健康水平,改善人类生活质量以及优化生活环境。如目前已能利用基因工程和发酵工程技术大量生产多肽和蛋白质药物,以取代传统的以动物组织为原料生产蛋白质药物的方法;利用基因工程和生化工程生产出大量安全可靠的疫苗;也可利用免疫…     

在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素

目的 构建以融合蛋白形式在大肠杆菌中高效表达心钠素的重组质粒,稳定高效地获得基因工程产品心钠素。方法 采用PCR和亚克隆技术构建带有心钠素的融合基因并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。利用操纵子重复克隆提高表达量,以凝血酶切割融合蛋白释放心钠素小肽并通过柱层析纯化蛋白质。检定产品的各项理化指标和大鼠的体内降压,体内利尿和体外舒张血管等药理活性。结果 构建了4个高效表达和心钠素融合蛋白的质粒,分别含1-4个目的基因串联操纵子;通过温度诱导表达后,该系列表达的目的分别为菌体总蛋白的46%、54.8%、56.1%和60.1%;提取纯化包涵体形式的融合蛋白后,以凝血酶切割释放心钠素,再经纯化分离出心钠素,实验室摇瓶发酵每升培养液可获3mg以上的纯度大于96%的产品,产品具有利尿,降压和舒张血管的药理活性。结论 利用融合基因的克隆与表达成功地研制了人心钠素基因工程产品。     

葡激酶在变铅青链霉菌中的克隆和分泌表达

目的　 构建可分泌表达葡激酶的基因工程链霉菌。方法　 通过 PCR方法扩增得到包括葡激酶结构基因和分泌信号肽基因在内的 730 bp的 DNA片段 ,将该片段插入变铅青链霉菌质粒 p IJ45 9的 erm强启动子下游 ,构建重组质粒p IJ45 9SAK,转化变铅青链霉菌 TK5 4。结果　 获得含有该重组质粒的基因工程菌株 ,经发酵培养基培养 72 h后 ,发酵液离心取上清用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,可见相对分子量约为 1 6 0 0 0的特异性蛋白条带 ;用溶纤平皿法可测得溶纤活性。结论　葡激酶已在所构建的基因工程菌中分泌表达且具有溶纤活性。     

肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌培养条件的优化

目的:对重组人肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌的培养条件进行研究,确定最佳培养方案以提高基因工程蛋白表达产量.方法:通过SDS-PAGE蛋白质电泳和电泳图谱扫描来分析诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导时间长短、培养温度和培养基成分对基因工程菌TB1表达肝癌相关抗原SMP-30的影响.结果:当工程菌培养条件合适,即在吸光度值A600为0.5左右时加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L,30℃培养7 h,其表达的SMP-30融合蛋白可占细体总蛋白量的46.1%.将工程菌培养温度从37℃降到30℃时,表达蛋白质的可溶性部分可提高10%～15%.结论:通过对重组人肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌的培养条件进行优化,获得较满意的应用工程菌表达肝癌相关抗原SMP-30的培养条件,为基因工程下游技术奠定了基础.     

基于ITS基因测序的闽产淡豆豉发酵过程优势菌种研究

目的:采用ITS技术(internal transcribed spacer,ITS序列基因测序)分析闽产淡豆豉发酵过程中优势菌种的动态变化。方法:收集闽产淡豆豉不同发酵阶段样品,运用ITS技术分析各阶段样品的真菌种类和数量的动态变化,探讨不同发酵阶段的菌种差异。结果:闽产淡豆豉发酵过程中粗糙脉孢菌、烟曲霉、黑曲霉、日本曲霉、黄曲霉、库德毕赤酵母、丝孢酵母、溜曲霉在发酵各阶段都占一定比例,尤其是粗糙脉孢菌、烟曲霉、黑曲霉、日本曲霉始终占较高比例。初步推断闽产淡豆豉发酵过程粗糙脉孢菌和曲霉属真菌为优势菌种,曲霉以烟曲霉、黑曲霉、日本曲霉为主。结论:淡豆豉发酵过程曲霉属真菌起到重要作用,通过优势菌种研究可为闽产淡豆豉的炮制工艺和炮制原理研究提供参考。     

基因工程抗体anti-HBsAg Fab原核表达体系大规模培养条件的实验研究

目的 探讨含anti-HBsAg Fab／pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件。方法 在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律．摸索最佳的培养模式及诱导表达条件。后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验，确定最佳补料模式。结果 由摇瓶发酵获得的数据表明，以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25℃条件下以0．2％阿拉伯糖诱导12h，Fab的得率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D600达到55．2，相当于湿菌含量110g／L水平；同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论 初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线．为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

利用家蚕病毒颗粒表达和纯化抗肿瘤药物天冬酰胺酶

目的：通过家蚕病毒颗粒简化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶的生产纯化过程,为抗肿瘤的药物生产提供依据。方法：利用基因重组技术构建pFastdual-polh-da26-asp融合蛋白真核表达载体,利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达融合蛋白,奈氏试剂法检测L-天冬酰胺酶活性。结果： 成功构建了重组表达载体,融合蛋白在家蚕细胞中顺利表达,并检测到L-天冬酰胺酶在家蚕细胞中表达,活性为2 113.52 U/mg。结论：重组病毒颗粒成功表达,且L-天冬酰胺酶具有一定的活性;可以利用家蚕颗粒病毒简化纯化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶。     

基因工程药物的安全性及其伦理问题

随着重组DNA技术的不断完善，基因工程药物的研制和利用日益增多。与此同时，基因工程药物的安全性及其伦理学问题也与日俱增。其主要体现在：重组DNA试验及大规模产业化过程中病原体的逃逸及其对人体的污染、基因工程药物的安全性、基因治疗的安全性及其伦理问题、基因工程药物与生态伦理及社会伦理、基因工程药物的研究与国际安全、基因工程药物对生物进化的影响等。本文在概述了基因工程药物现状和存在的安全性及伦理问题的基础上，提出了与之相应的对策，并对所提出的对策进行了初步的理论探讨。