人大网膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导化分方法

目的建立人大网膜脂肪问充质干细胞（adiposederivedIIlesechymalSteITIcells,ADSCs）的原代培养及诱导分化为脂肪细胞的方法．方法术中取人大网膜脂肪组织,采用胶原酶消化法原代培养,经流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34、CD90和CD45分子、MTTr法测定细胞生长曲线,取P3细胞以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松及吲哚美辛诱导该细胞向脂肪细胞分化,油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定．结果培养卅的细胞形态均-呈梭形或漩涡状生长,经流式细胞仪鉴定为ADSCs,细胞生长曲线表明P3细胞增值旺盛,用分化培养基诱导后,细胞形态由梭形变为圆形,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红0染色鉴定为成熟的脂肪细胞．结论该方法能培养出形态均一的人大网膜ADSCs,经诱导后可向成熟脂肪细胞分化．     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的探索人前脂肪细胞的原代培养方法.方法取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性.结果培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞.结论在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞.组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础.     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的 探索人前脂肪细胞的原代培养方法。方法 取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性。结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞。结论 在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞。组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础。     

小鼠皮下和内脏前脂肪细胞原代培养模型的建立

目的:探索小鼠皮下和内脏前脂肪细胞的培养方法?方法:取C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下脂肪和附睾旁内脏脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导后分化率高,经油红O染色证实分离获得的前脂肪细胞可以分化为成熟脂肪细胞,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因Fabp4(fatty acid binding protein 4)的表达量明显升高?结论:从C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下和附睾旁内脏脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的皮下和内脏前脂肪细胞,这种前脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究皮下?内脏脂肪功能的差异提供了良好的基础?     

小鼠棕色脂肪原代培养模型的建立

目的:探索小鼠棕色脂肪细胞原代培养的方法?方法:取C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养出来的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导分化后分化率高,经油红O染色证实为脂肪细胞,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因UCP-1表达量明显升高?结论:从C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的前棕色脂肪细胞,这种棕色脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究棕色脂肪的功能提供了良好的基础?     

人网膜前脂肪细胞原代培养及其生物学特性研究

目的建立人网膜前脂肪细胞原代培养的方法,研究内脏脂肪增生肥大和内分泌功能的生物学特性。方法选取人网膜脂肪组织,采用酶消化细胞原代培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学观察、MTT法测定生长曲线、油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定、酶联免疫法测定脂肪细胞因子瘦素和脂联素水平。结果培养出的梭形细胞成分均一。第3天开始增殖,4～9d为指数增长期,倍增时间约为60h。经分化诱导21d约有90％的细胞分化为成熟脂肪细胞。前脂肪细胞可检出低水平瘦素分泌,经诱导分化分泌量持续增多,第17天达峰值（1．6ng·ml^-1·24h^-1）,之后保持高分泌状态至诱导结束;而脂联素直到诱导分化第7天始可检测到低水平分泌,此时光镜下已可见胞质含脂滴的细胞;7～17d分泌逐渐增多,第17天分泌达峰值（99ng·ml^-1·24h^-1）,之后有明显下降趋势。经油红0脂肪染色和瘦素、脂联素分泌检测证实分离培养的细胞为功能活跃的前脂肪细胞。结论成功建立了人网膜前脂肪细胞模型,观察到瘦素和脂联素不同分泌模式。脂联素可作为鉴定前脂肪细胞分化成熟的内分泌功能特异标志物。     

人眼眶前脂肪细胞的培养和诱导分化及鉴定

目的近来研究显示,人眼眶脂肪组织中的前脂肪细胞可能参与多种疾病的发病过程。文中建立人眼眶前脂肪细胞原代培养模式,对其进行培养、诱导分化及鉴定,以便深入了解人眼眶前脂肪细胞的生物学特性。方法从18～56岁成人眼眶脂肪组织中分别以组织块法及酶消化法分离得到前脂肪细胞,进行形态学观察,成脂诱导分化,并对其进行鉴定。结果 2种方法均可获得前脂肪细胞,细胞为长梭形,呈"S"形生长,可成脂分化,且油红O染色阳性。结论从人眼眶脂肪组织中可分离出纯度高、增殖快、成脂分化率高的前脂肪细胞。     

大鼠前脂肪细胞消化酶原代培养方法改良的探讨

目的:改进大鼠前脂肪细胞的原代培养方法.方法:对Poznanski胶原酶消化法进行改良,包括延长胶原酶消化法时间、3次离心和2次滤网过滤,分化培养后采用油红O染色埘细胞进行鉴定,通过形态学观察、生长曲线的绘制确定原代培养大鼠前脂肪细胞的细胞学特性.结果:用改良后的方法获得大量成份均一、生长旺盛的前脂肪细胞,细胞活力测定90%为活细胞;前脂肪细胞5 d左右进入指数增长期,8 d左右达到平台期,倍增时间约为60 h;在分化培养基的诱导下可以向脂肪细胞分化.结论:实验成功地建立了前脂肪细胞培养体系,较原方法更加有效.     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

[目的]研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞,在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞,探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用.[方法]选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒,共8例(8只眼),采用组织块培养法培养细胞,观察细胞形态;细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达,初步验证前脂肪细胞的存在;诱导细胞向成熟脂肪细胞分化,油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况;RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变.[结果]原代培养细胞为梭形,增殖旺盛;免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性;细胞可分化为成熟脂肪细胞,并伴有PPARγ基因表达的增强.[结论]TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞;进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用.     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

【目的】研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞，在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞，探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用。【方法】选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒，共8例(8只眼)，采用组织块培养法培养细胞，观察细胞形态；细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达，初步验证前脂肪细胞的存在；诱导细胞向成熟脂肪细胞分化，油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况；RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变。【结果】原代培养细胞为梭形，增殖旺盛；免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性；细胞可分化为成熟脂肪细胞，并伴有PPARγ基因表达的增强。【结论】TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞；进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究

目的 探讨构建可注射型组织工程化脂肪组织的可行性,为临床修复软组织缺损寻求简便、微创的方法 .方法 采用酶消化法从人脂肪抽吸术的抽吸物中脂质部分获取人脂肪来源干细胞(ASC),以经成脂诱导和未经成脂诱导的ASC作为种子细胞,行DiI体外荧光标记后,分别以1×107个/ml细胞密度与纤维蛋白胶可注射支架复合.取6只裸鼠,将成脂诱导ASC-支架复合物注射于其背部左下方皮下(诱导组),未诱导ASC-支架复合物注射于背部右下方皮下(未诱导组),不加细胞的纤维蛋白胶注射于颈部正中皮下(空白支架组),每点注射0.2 ml.第12周末处死裸鼠取出移植物,通过大体观察、湿重测定、常规组织病理学检测、油红O染色和DiI荧光标记检测判断体内成脂能力.结果 诱导组和未诱导组均获得了外观类似脂肪组织的新生物,新生物湿重分别为(28±15)、(22±t6)mg(t=23.238,P<0.01).诱导组新生物常规组织病理学检查及油红O染色均证实为成熟脂肪组织,DiI荧光标记呈阳性,证实为外源性ASC;未诱导组新生物中见少量成熟脂肪组织,大部分为纤维样结构;空白对照组未见新生组织形成.结论 从人吸脂术抽吸物脂质部分提取的ASC能作为种子细胞,经成脂诱导后与纤维蛋白胶可注射支架复合,可在体内成功构建成熟脂肪组织.     

小檗碱对人大网膜前脂肪细胞增殖与分化影响的初探

目的观察小檗碱对人大网膜前脂肪细胞增殖与分化的作用。方法原代分离培养人大网膜前脂肪细胞,在其增殖和分化的两个阶段分别加入不同浓度的小檗碱,以四甲基偶氮唑盐(MTT)方法和油红O染色观察不同时间段小檗碱对细胞增殖分化的影响。结果小檗碱对人大网膜前脂肪细胞的增殖有促进作用,对分化过程中的脂肪积聚有抑制作用。结论小檗碱促进前脂肪细胞的增殖和抑制分化作用可能与它具有潜在的减肥、降脂作用有关。这为小檗碱治疗肥胖2型糖尿病患者及增加胰岛素敏感性的疗效提供理论依据。     

大鼠脂肪间充质干细胞体外培养及其分化研究

目的:建立大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养体系并研究其多向分化潜能。方法:取6周龄大鼠双侧腹股沟和附睾处脂肪,酶解法分离培养原代脂肪间充质干细胞,绘制第三代细胞生长曲线。成脂诱导4 d,成骨诱导培养18 d,分别通过油红O染色、碱性磷酸酶活性检测和钙盐沉积VonKossa染色来观察细胞成脂、成骨表型转化。结果:大鼠脂肪中能分离培养出一定量的脂肪间充质干细胞,其群体倍增时间为(60±3.2)h。在成脂诱导培养液作用下可分化为脂肪细胞;成骨诱导培养液作用下,可特异性表达成骨分化标志碱性磷酸酶,同时也具有矿化细胞外基质的能力。结论:脂肪间充质干细胞具有易于取材、大量分离培养和定向诱导成骨分化的特点,是骨组织工程理想的种子细胞的来源。