白介素-1β对MN9D细胞Nurr1及酪氨酸羟化酶表达的影响

利用具有未成熟特性的多巴胺(DA)合成细胞系MN9D,观察白介素-1beta(IL-1β)对MN9D细胞内源性孤儿核受体Nurr1表达的作用,并研究Nurr1表达增高对MN9D细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨Nurr1调控DA能神经元发育的机制。用20 ng/ml的IL-1β作用于MN9D细胞,于IL-1β作用的2、4、6 h用相差显微镜观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学染色及Western blot方法检测IL-1β作用后MN9D细胞内源性Nurr1蛋白表达的变化,以及Nurr1表达变化对MN9D细胞TH表达的影响。结果显示:经20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞的形态与未经IL-1β作用的细胞相比没有明显改变。从加入IL-1β2 h起,直至6 h,MN9D细胞Nurr1免疫荧光染色强度比未加IL-1β作用的正常对照组细胞明显增强,但此时MN9D细胞中TH阳性细胞的百分比与正常对照组相比没有明显改变(P>0.05)。Western blot结果显示:20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞Nurr1蛋白表达分别为233%、232%和254%,经统计学检验,与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。而IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞TH蛋白的表达分别为97%、107%和105%,但经统计学检验,与正常对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。本研究结果表明,IL-1β在2～6 h可迅速明显激活MN9D细胞内源性Nurr1的表达,但此时单纯Nurr1表达增加并不影响MN9D细胞TH的表达;TH的表达激活可能还需要除Nurr1外的其它特殊的细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。     

PKA信号通路参与调控肝细胞cAMP反应元件结合蛋白与PGC-1α的表达

目的观察蛋白激酶A(PKA)信号通路对培养的肝细胞环腺苷酸(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化及过氧化物酶增殖激活受体协同激活因子α(PGC-1α)表达的调控作用。方法利用PKA抑制剂H89和cAMP激动剂Forskolin预处理原代培养的大鼠肝脏细胞,以Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定不同处理组CREB/P-CREB蛋白及PGC-1αmRNA的表达变化。结果以Forskolin作用的肝细胞,与对照组相比,CREB蛋白的磷酸化和PGC-1αmRNA的表达水平明显增高;预先加入PKA抑制剂H89,再加入Forskolin作用细胞,则CREB蛋白磷酸化和PGC-1αmRNA表达受到明显抑制(P<0.01),差异有统计学意义。结论 PKA信号通路参与调控肝细胞CREB的磷酸化和PGC-1α的表达,可能与糖代谢的调节有关。     

白介素-1β对MN9D细胞Nurrl及酪氨酸羟化酶表达的影响

利用具有未成熟特性的多巴胺(DA)合成细胞系MN9D,观察白介素-lbeta(IL-1β)对MN9D细胞内源性孤儿核受体Nurrl表达的作用,并研究Nrrl表达增高对MN9D细胞酪氨酸羟化酶(1H)表达的影响,探讨Nurrl调控DA能神经元发育的机制.用20 ng/ml的IL-1β作用于MN9D细胞,于IL-1β作用的2、4、6 h用相差显微镜观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学染色及Western blot方法榆测IL-1β作用后MN9D细胞内源性Nul1蛋白表达的变化,以及Nurrl表达变化对MN9D细胞TH表达的影响.结果显示:经20 ns/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞的形态与未经IL-1β作用的细胞相比没有明显改变.从加入IL-1β2 h起,直至6 h,MN9D细胞Nul1免疫荧光染色强度比未加IL-1β作用的正常对照组细胞明显增强,但此时MN9D细胞中TH阳性细胞的百分比与正常对照组相比没有明显改变(P＞0.05).Western blot结果显示:20 ng/ml的IL-1B作用2、4、6 h,MN9D细胞Nurrl蛋白表达分别为233%、232%和254%,经统计学检验,与正常对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).而IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞TH蛋白的表达分别为97%、107%和105%,但经统计学检验,与正常对照组相比没有显著性差异(P＞0.05).本研究结果表明,IL-1β在2～6 h可迅速明显激活MN9D细胞内源性Nurrl的表达.但此时单纯Nurrl表达增加并不影响MN9D细胞TH的表达;TH的表达激活可能还需要除Nurrl外的其它特殊的细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用.     

外源性Nurr1基因过表达对SK-N-SH细胞分化作用的研究

为研究外源性Nurr1基因过表达对转染细胞的作用,探讨Nurr1基因调控多巴胺能神经元分化的机制。本研究应用:(1)pBK- RSV -Nurr1质粒经脂质体法转染SK- N- SH细胞,G418筛选;用RT PCR和免疫细胞化学方法检测基因转染细胞Nurr1mRNA及Nurr1蛋白的表达; (2)all- trans- RA、9- cis- RA、forskolin诱导基因转染细胞,RT PCR及免疫荧光细胞化学方法检测基因转染细胞MAP2 和TH的表达。结果显示: (1)经RT -PCR检测,基因转染细胞表达Nurr1mRNA;免疫细胞化学染色结果显示基因转染细胞表达Nurr1蛋白,说明外源性Nurr1基因在转染细胞内过表达;基因转染细胞形态与正常细胞相比没有明显变化,生长速度略有降低并表达成熟神经元的特异性标识物MAP2,但不表达多巴胺能神经元的特异性标识物TH。(2)尽管RA、forskolin诱导可促进Nurr1基因转染的SK- N- SH细胞进一步向成熟神经元分化,但不能诱导基因转染细胞表达TH。结论:单纯的Nurr1过表达可以促进SK- N- SH细胞向成熟神经元方向分化,但不足以激活TH基因转录。TH基因的转录激活还需要除Nurr1以外的其它细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。     

α-突触核蛋白与Nurr1相互作用增强致小鼠小胶质细胞系肿瘤坏死因子α表达增多

 目的 在BV2细胞中,探讨?-突触核蛋白( ?-Syn)与Nurr1之间是否存在相互作用及其对肿瘤坏死因子?( TNF-?)分泌的影响。方法 用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）和免疫组织化学染色观察?-Syn和Nurr1之间是否存在相互作用,用免疫组织化学和蛋白印迹观察Nurr1核转位,用酶联免疫技术（Elisa）检测TNF-?的释放量。结果 ?-Syn和Nurr1存在共定位,?-Syn和Nurr1可能存在相互作用。 过表达?-Syn时Nurr1的核转位减少,单独过表达?-syn使得TNF-?分泌增加;而同时过表达Nurr1可以明显抑制TNF-?产生。结论 ?-Syn可能通过与Nurr1相互作用从而减少其核转位,导致TNF-?产生增多,这可能是?-Syn介导胶质细胞活化引起炎症的机制之一。     

大鼠中脑发育早期Nurr1时空模式及与TH表达的相关性

目的:观察孤儿核受体相关因子1(Nuclear receptor-related factor1,Nurr1)在大鼠胚胎中脑发育过程中的时空表达模式及与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的相关性。方法:制备大鼠胚胎E12.5、E13.5、E14.5d中脑脑片,行Nurr1/TH的免疫荧光双标记。在荧光显微镜下分别计数每个视野下TH、Nurr1单标神经元和Nurr1/TH双标神经元的数量,用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果:Nurr1/TH双标神经元在E12.5d时较少,随着发育时间的推移逐渐增加,至E14.5d时TH阳性细胞中几乎均有Nurr1的表达。结论:本研究结果进一步从形态学的角度提示转录因子Nurr1在胚胎发育过程中对中脑多巴胺(dopamine,DA)能神经元的发育起重要作用。     

PD模型大鼠黑质中Nurr1和TH的表达变化及其意义

为探讨孤儿核受体(Nurr1)在多巴胺能神经元损伤修复过程中对特异性表型酪氨酸羟化酶(TH)的影响,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠一侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病(PD)模型,分别应用Western blot和免疫组织化学技术观察不同时间点中脑黑质中Nurr1、TH蛋白表达的变化及其相关性。结果显示,Nurr1蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中即明显下降,7d后开始逐渐上升,14d接近正常水平,28d明显升高;TH蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中无明显变化,7d开始下降,14d达最低,28d开始上升。上述结果提示,在6-OHDA损伤黑质-纹状体通路后,Nurr1的表达先下降后上升,其表达变化早于TH,可能在PD模型大鼠的损伤修复中发挥重要作用。     

大鼠生后视网膜发育过程中Nurr1与TH的相关关系研究

目的:观察核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,Nurr1)与多巴胺能神经细胞特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)在生后大鼠视网膜发育过程中的表达变化,探明Nurr1与视网膜多巴胺能神经元的相关关系。方法:石蜡包埋组织切片,免疫组织化学双重标记。结果:Nurr1在视网膜发育过程中的表达出现了显著的动态变化,Nurr1阳性产物主要表达在内核层细胞,生后3～7 d达到高峰,之后随着细胞的成熟阳性表达又逐渐减少,成熟的视网膜组织内仅见少量Nurr1阳性细胞,在视网膜神经细胞从幼稚到成熟的分化过程中仅见个别TH阳性细胞。Nurr1与TH的免疫组化双标结果显示两蛋白可以共表达在同一细胞中,但众多的Nurr1阳性细胞不表达TH。结论:Nurr1在大鼠视网膜多巴胺能神经细胞及非多巴胺能神经细胞从幼稚到成熟的分化过程中可能具有重要的调控作用。     

Forskolin对人WISH细胞水通道蛋白 8 表达及分布的影响

 目的 探究调控人羊膜上皮细胞水通道蛋白8（AQP8）表达的信号转导通路 。方法 以腺苷酸环化酶激动剂 Forskolin 处理体外培养的人羊膜上皮细胞株 WISH 细胞，将 WISH 细胞随机分为不同浓度 Forskolin 作用 24 h 组和单一浓度 Forskolin 作用不同时间组。前者培养基中分别加入 Forskolin 0（对照组）、5、10、20、40、100、200 μmol/L，培养 24 h；后者培养基中加入 Forskolin 100 μmol/L 后分别培养 4、8、16、24、48 h。采用蛋白质印迹技术检测各组细胞 AQP8 蛋白表达水平；RT-PCR 技术检测 Forskolin 处理不同时间组细胞 AQP8 mRNA 表达水平；免疫荧光细胞化学方法检测 Forskolin 100 μmol/L 作用 24 h 组细胞 AQP8 蛋白的分布。结果 对照组 WISH 细胞 AQP8 蛋白表达水平为 0.027 ± 0.003，AQP8 mRNA 表达水平为 0.026 ± 0.003。不同浓度 Forskolin 处理组中，除了 5 μmol/L 组外，其余各组 AQP8 蛋白表达水平均高于对照组（P < 0.05），高峰值出现在 100 μmol/L 组（0.157 ± 0.006）。Forskolin 处理不同时间的各组 WISH 细胞，其 AQP8 mRNA 和蛋白的表达水平均高于对照组（P < 0.05），AQP8 mRNA 表达水平在 16 h 组达峰值（0.087 ± 0.007），AQP8 蛋白表达水平在 24 h 组达峰值（0.158 ± 0.007）。免疫荧光细胞化学染色显示，Forskolin 100 μmol/L 作用 24 h 组细胞膜上的黄绿色免疫荧光信号较对照组明显增强。结论 Forskolin 可上调 WISH 细胞 AQP8 mRNA 及蛋白表达水平，使细胞膜上 AQP8 蛋白的分布增加，提示细胞内 cAMP-蛋白激酶 A 信号转导途径的激活在人羊膜上皮细胞 AQP8 表达的调控中发挥重要作用。     

表皮生长因子对卵巢激活素基因表达的调节及其信号通路

背景：激活素作为卵巢内调控分子,对卵巢卵泡发育起着重要作用。 目的：探索表皮生长因子在激活素基因表达过程中所起的重要作用以及可能参与调节的信号通路。 方法：分离斑马鱼卵巢卵泡,体外培养6 d,消化后传代培养24 h。表皮生长因子单独或与其他分子抑制剂(AG1478、H89、GF109203X)或激动剂(FK、PMA)联合处理细胞,提取细胞RNA,反转录PCR检测细胞激活素表达量。 结果与结论：表皮生长因子可快速提高激活素表达量,其作用可能是通过磷酸化信号分子丝裂原活化蛋白激酶实现,而蛋白激酶C特异性抑制剂或激动剂可减弱或加强表皮生长因子对丝裂原活化蛋白激酶信号分子的激活,显示卵巢内激活素表达受表皮生长因子调节,蛋白激酶C/丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了这种调节作用。蛋白激酶A抑制剂也能抑制表皮生长因子对激活素表达的促进作用。     

Genistein prevents thyroid hormone-dependent tail regression of Rana catesbeiana tadpoles by targetting protein kinase C and thyroid hormone receptor alpha.

Thyroid hormone (TH)-regulated gene expression is mainly mediated by TH binding to nuclear thyroid hormone receptors (TRs). Despite extensive studies in mammalian cell lines that show that phosphorylation signaling pathways are important in TH action, little is known about their roles on TH signaling in vivo during development. Anuran metamorphosis is a postembryonic process that is absolutely dependent upon TH and tadpole tail resorption can be precociously induced by exogenous administration of 3,5,3'-triiodothyronine (T(3)). We demonstrate that genistein (a major isoflavone in soy products and tyrosine kinase inhibitor) and the PKC inhibitor (H7) prevent T(3)-induced regression of the Rana catesbeiana tadpole tail. T(3)-induced protein kinase C tyrosine phosphorylation and kinase activity are inhibited by genistein while T(3)-induced up-regulation of TRbeta mRNA, but not TRalpha mRNA, is significantly attenuated, most likely through inhibition of T(3)-dependent phosphorylation of the TRalpha protein. This phosphorylation may be modulated through PKC. These data demonstrate that T(3) signaling in the context of normal cells in vivo includes phosphorylation as an important factor in establishing T(3)-dependent tail regression during development.     

转染Nurrl基因的大鼠骨髓基质细胞的诱导分化

目的 通过克隆孤儿核受体(Nurrl)基因并转染大鼠的骨髓基质细胞(MSCs),探讨Nurrl基因对MSCs在三七总皂甙(tPNS)和全反式维甲酸(ATRA)的联合诱导下向神经元分化的影响.方法 构建pcDNA3.1-hygro-Nurrl表达质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000转染MSCs.转染前MSCs以相同的密度铺6孔板,并随机设置4个实验组,分别是:Nurrl tPNS/ATRA组、tPNS/ATRA组、Nurrl组和对照组,利用免疫细胞化学方法检测Nurrl基因的表达.转染48 h对Nurrl tPNS/ATRA组和tPNS/ATRA组的细胞,依次给予β-疏基乙醇(BME)预诱导和tPNS/ATRA诱导,而Nurrl组和对照组的细胞除给予培养基代替tPNS/ATRA诱导剂外,其余步骤均相同;检测4组细胞的酪氨酸羟化酶(TH)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和γ-氨基丁酸(GABA)抗体的免疫细胞化学结果并统计各组阳性细胞的比例.结果 免疫细胞化学显示,转染的骨髓基质细胞表达Nurrl蛋白;Nurrl tPNS/ATRA组TH阳性细胞比例明显高于tPNS/ATRA组,分别是(38.4±4.6)%和(5.9±3.4)%.结论 用tPNS/ATRA作诱导剂,转染Nurrl的MSCs诱导后TH阳性细胞的比例明显高于未转染组,差别有统计学意义;tPNS/ATRA诱导MSCs分化成神经元细胞的作用明确.     

慢病毒介导核受体相关因子1基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠

目的探讨慢病毒介导核受体相关因子1(Nurrl)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植至帕金森病(PD)模型大鼠纹状体后对PD大鼠的治疗作用。方法采用神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)纹状体注射成功制备PD大鼠模型18只,将携带绿色荧光的慢病毒GV287-Nurr1感染大鼠BMSCs,然后随机移植入6只PD模型大鼠的纹状体内(实验组),设生理盐水组(假移植组)6只及感染空慢病毒GV287的BMSCs组(对照组)6只;术后第1、2、4周观察大鼠的行为改善情况;免疫组织化学染色法检测纹状体及黑质中Nurrl和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达变化;RT-PCR法检测黑质Nurrl mRNA和TH mRNA的表达变化。结果慢病毒感染后的BMSCs及上清中均检测到Nurr1蛋白;对照组与实验组大鼠在移植后第1、2、4周的旋转行为较假移植组均有所改善,且实验组比对照组改善更明显;实验组纹状体Nurr1阳性细胞有效存活并沿胼胝体向皮质及对侧脑组织迁移;实验组纹状体及黑质损毁侧Nurrl和TH蛋白及mRNA的表达较假移植组和对照组明显增高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导Nurr1基因修饰大鼠BMSCs移植治疗PD大鼠,能有效地改善PD模型大鼠的行为学症状,增加大鼠脑内纹状体和黑质区Nurr1和TH的表达。     

Porins from Salmonella enterica serovar Typhimurium activate the transcription factors activating protein 1 and NF-kappaB through the Raf-1-mitogen-activated protein kinase cascade.

In this study we examined the ability of Salmonella enterica serovar Typhimurium porins to activate activating protein 1 (AP-1) and nuclear factor kappaB (NF-kappaB) through the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade, and we identified the AP-1-induced protein subunits. Our results demonstrate that these enzymes may participate in cell signaling pathways leading to AP-1 and NF-kappaB activation following porin stimulation of cells. Raf-1 was phosphorylated in response to the treatment of U937 cells with porins; moreover, the porin-mediated increase in Raf-1 phosphorylation is accompanied by the phosphorylation of MAPK kinase 1/2 (MEK1/2), p38, extracellular-signal-regulated kinase 1/2, and c-Jun N-terminal kinase. We used three different inhibitors of phosphorylation pathways: 2'-amino-3'-methoxyflavone (PD-098059), a selective inhibitor of MEK1 activator and the MAPK cascade; 4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazole (SB203580), a specific inhibitor of the p38 pathway; and 7beta-acetoxy-1alpha,6beta,9alpha-trihydroxy-8,13-epoxy-labd-14-en-11-one (forskolin), an inhibitor at the level of Raf-1 kinase. PD-098059 pretreatment of cells decreases AP-1 and NF-kappaB activation by lipopolysaccharide (LPS) but not by porins, and SB203580 pretreatment of cells decreases mainly AP-1 and NF-kappaB activation by porins; in contrast, forskolin pretreatment of cells does not affect AP-1 and NF-kappaB activation following either porin or LPS stimulation. Our data suggest that the p38 signaling pathway mainly regulates AP-1 and NF-kappaB activation in cells treated with S. enterica serovar Typhimurium porins. Antibody electrophoretic mobility shift assays showed that JunD and c-Fos binding is found in cells treated with porins, in cells treated with LPS, and in unstimulated cells. However, by 30 to 60 min of stimulation, a different complex including c-Jun appears in cells treated with porins or LPS, while the Fra-2 subunit is present only after porin stimulation. These data suggest different molecular mechanisms of activation induced by porins or by LPS.