β联蛋白对过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞增殖活性及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

目的 观察高表达的β联蛋白对过氧化氢（H2O2）诱导衰老人皮肤成纤维细胞（HSF）增殖活性以及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。 方法 实验分3组。HSF细胞分别转染pcDNA3.1-β联蛋白或空载体pcDNA3.1,然后150 μmol/L H2O2处理2 h。噻唑蓝检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,RT-PCR和Western印迹分析凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。 结果 HSF + 空载体组、HSF + 空载体 + H2O2组、HSF + β联蛋白 + H2O2组细胞增殖活性分别为0.792 ± 0.012、0.462 ± 0.012、0.521 ± 0.015,细胞凋亡率分别为（3.407 ± 0.217）%、（24.555 ± 1.793）%、（15.360 ± 0.755）%,各组比较,差异有统计学意义（均P ＜ 0.01）。HSF + 空载体 + H2O2组Bcl-2 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.333 ± 0.003和0.336 ± 0.004）明显低于HSF + 空载体组（分别为0.507 ± 0.013和0.514 ± 0.021）,两组比较,均P ＜ 0.01。HSF + β联蛋白 + H2O2组Bcl-2 mRNA和蛋白水平分别为0.404 ± 0.006和0.411 ± 0.005明显高于HSF + 空载体 + H2O2组,两组比较,均P ＜ 0.01。HSF + 空载体 + H2O2组Bax mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.451 ± 0.002和0.460 ± 0.008）明显高于HSF + 空载体组,两组比较,均P ＜ 0.01。HSF + β联蛋白 + H2O2组Bax mRNA和蛋白水平（分别为0.339 ± 0.012和0.346 ± 0.013）明显低于HSF + 空载体 + H2O2组,两组比较,均P ＜ 0.01。 结论 高表达的β联蛋白能够提高衰老人皮肤成纤维细胞增殖活性。     

紫外线和人乳头状瘤病毒16 E6协同诱导、促进裸鼠皮肤鳞状细胞癌的机制研究

【摘要】 目的 构建裸鼠皮肤鳞状细胞癌（CSCC）移植瘤模型,探讨紫外线（UV）损伤及人乳头瘤病毒（HPV）感染诱导、促进CSCC的协同作用机制。方法 将人CSCC细胞A431分成3组,即用 HPV16 E6腺病毒转染的HPV16 E6 过表达组,空白腺病毒转染的空白载体组（简称空载组）,未进行腺病毒转染的空白对照组。使用无血清DMEM培养基将空载组及HPV16 E6过表达组（LV-OE-HPV16 E6组）A431细胞制成单细胞悬液,分别接种于SKH-1裸鼠左侧臀部皮下作为空载组（n = 16）和LV-OE-HPV16 E6组（n = 16）。每3天观察并记录小鼠肿瘤生长情况,当瘤体达到150 mm3时,视为建模成功。建模成功后,每组取8只小鼠进行UV照射,分为4组,即空载组、空载 + UV组、LV-OE-HPV16 E6组、LV-OE-HPV16 E6 + UV组,UV照射剂量为1 440 mJ/（cm2·d）,每次12 min,持续4周后处死裸鼠,测量瘤重及体积,绘制肿瘤生长曲线,免疫组化、Western印迹和qRT-PCR检测验证Wnt1、β联蛋白mRNA及蛋白在裸鼠CSCC中的表达。数据若符合正态分布,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;数据若不符合正态分布,采用秩和检验对数据进行统计分析。结果 空载 + UV组瘤重为（2.90 ± 0.36） g,LV-OE-HPV16 E6组（3.19 ± 0.32） g,LV-OE-HPV16 E6 + UV组（4.41 ± 0.18） g,与空载组（2.20 ± 0.24） g比较,差异均有统计学意义（t值分别为4.39、6.77、20.11,均P＜0.001）;空载 + UV组瘤体积为（1 033.12 ± 400.15） mm3,LV-OE-HPV16 E6组（1 119.21 ± 447.57） mm3,LV-OE-HPV16 E6 + UV组（1 464.29 ± 409.98） mm3,与空载组（688.94 ± 319.31） mm3比较差异均有统计学意义（t值分别为1.90、2.21、4.22,均P＜0.001）。免疫组化显示,4组间Wnt1、β联蛋白表达水平差异无统计学意义（F值分别为0.76、0.71,均P > 0.05）;Western印迹显示,4组间Wnt1、β联蛋白水平差异有统计学意义（F值分别为16.74、49.90,均P＜0.05）,且LV-OE-HPV16 E6 + UV组Wnt1、β联蛋白水平高于空载组、空载 + UV组和LV-OE-HPV16 E6组（均P＜0.05）。mRNA水平分析显示,4组间组织中Wnt1、β联蛋白mRNA水平差异均有统计学意义（F值分别为7.77、8.38,均P＜0.05）,且LV-OE-HPV16 E6 + UV组Wnt1 mRNA水平高于空载组、空载 + UV组和LV-OE-HPV16 E6组（均P＜0.05）。结论 UV和HPV感染在诱导、促进CSCC中具有协同作用。     

染料木黄酮对预防成纤维细胞光化学损伤的影响

目的 探讨染料木黄酮在PUVA所致体外培养真皮成纤维细胞光老化模型中的保护作用。 方法　运用PUVA联合构建体外培养真皮成纤维细胞光老化模型,噻唑蓝比色法（MTT法）确定染料木黄酮最适光保护作用浓度,倒置显微镜下观察细胞形态,酶组织化学法观察细胞衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）表达,流式细胞仪检测细胞活性氧（ROS）含量,实时荧光定量PCR检测细胞基质金属蛋白酶1（MMP-1）mRNA表达等。 结果　UVA照射后24 h,正常对照组、光老化组及染料木黄酮组SA-β-Gal阳性细胞率分别为（0.67 ± 0.58）%、（96.67 ± 1.53）%、（51.67 ± 2.08）%,各组间差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。光老化组、染料木黄酮组ROS含量分别为正常对照组的（1.88 ± 0.24）和（1.62 ± 0.02）倍（均P ＜ 0.01）。光老化组MMP-1 mRNA表达上调为正常对照组的10倍,染料木黄酮组表达量仅为正常对照组的6倍,各组间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论　染料木黄酮对PUVA所致体外培养真皮成纤维细胞光老化具有一定的保护作用。 【关键词】 染料木黄酮; PUVA疗法; 成纤维细胞; 光; 细胞衰老     

原发性乳房外Paget病组织中钠氢交换子调节因子1和β联蛋白的表达和意义

【摘要】 目的 探讨钠氢交换子调节因子1（NHERF1）和β联蛋白在原发性乳房外Paget病组织中的表达及其意义。 方法 应用免疫组化方法,检测18例原位乳房外Paget病、22例侵袭性乳房外Paget病石蜡组织切片中NHERF1和β联蛋白的表达情况。 结果 NHERF1在22例侵袭性乳房外Paget病中18例（81.82%）为高表达,18例原位乳房外Paget病中7例（38.89%）高表达,两组差异有统计学意义（χ2 = 7.78,P ＜ 0.01）;β联蛋白在侵袭性乳房外Paget病中有0例胞膜高表达和18例（81.82%）胞质或核高表达,原位乳房外Paget病中分别为6例（33.33%）和8例（44.44%）,两组差异均有统计学意义（χ2值分别为8.63和6.08,P值分别 ＜ 0.01和 ＜ 0.05）。原发性乳房外Paget病组织中NHERF1的表达与β联蛋白胞膜表达呈负相关（ρ = -0.488,P ＜ 0.01）,与β联蛋白胞质或核表达呈正相关（ρ = 0.623,P ＜ 0.01）;β联蛋白胞膜表达与胞质或核表达呈负相关（ρ = -0.572,P ＜ 0.01）。 结论 乳房外Paget病组织中NHERF1和β联蛋白表达异常,并可能与原发性乳房外Paget病的发生发展及侵袭有关。 【关键词】 佩吉特病,乳腺外; β连环素; 钠氢交换子调节因子1     

白介素2与梅毒螺旋体膜蛋白Gpd双价核酸疫苗的免疫活性及保护作用研究

目的 探讨白介素2(IL-2)基因与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Gpd抗原编码基因融合构建双价核酸疫苗免疫新西兰兔后的免疫应答效果及感染Tp后的保护作用.方法 定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2,与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd真核表达重组体分别设为两个疫苗实验组,同时设pcDNA3.1(+)空质粒对照组及PBS对照组,共4组,每组18只雄性新西兰兔,肌肉多点注射初次免疫,于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行感染实验,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同时间点免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及干扰素γ(IFN-γ)诱导水平,噻唑蓝法检测兔脾淋巴细胞增殖水平.结果 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2融合双价疫苗和pcDNA3.1(+)/Gpd单基因疫苗在免疫期间和感染期间均能检测到高滴度的IgG特异性抗体,最高滴度分别可达1∶4096和1∶1024(P值均＜0.01);两疫苗组之间在免疫及感染期间不同时间点比较差异也有统计学意义(P值均＜ 0.01);免疫后第8周双价融合核酸疫苗组及单基因核酸疫苗组兔脾细胞培养上清中IFN-γ分别为(447±22.4)μg/L、(225±17.6)μg/L,IL-2分别为(167±15.7)μg/L、(110±12.6)μg/L,均高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01);感染期间不同时间点兔脾细胞受相应蛋白刺激均有明显增殖反应,检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01).早期感染皮损观察显示双价融合核酸疫苗组较之单基因疫苗组有着更低的皮损Tp检测阳性率(17.5％)、溃疡病灶发生率(15％)以及更短的皮损愈合时间.结论 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2双基因融合疫苗在兔体内能更有效地诱导保护性体液免疫和细胞免疫应答.     

沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤的影响

【摘要】 目的 探讨沉默miRNA-23a对UVB照射所致成纤维细胞慢性光损伤的影响。 方法 将成纤维细胞分为空白对照组、UVB光损伤组、miRNA-23a 沉默组、UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组。SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色测定老化程度,流式细胞仪检测细胞周期,实时PCR法检测p53、p16、p21 mRNA的表达,免疫印迹法检测p53、p16、p21的蛋白表达量。 结果 UVB光损伤组与UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的SA-β-Gal细胞蓝染阳性率分别为（94.60 ± 2.58）%、（48.18 ± 3.70）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。G1期阻滞率分别为（85.06 ± 1.52）%、（57.48 ± 2.01）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量与UVB光损伤组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞衰老有抑制作用,而miRNA-23a对下游衰老相关信号分子的抑制可能是其机制之一。     

HHV-8 K1蛋白与卡波氏肉瘤

目的 探讨HHV-8 Kl在卡波氏肉瘤发病机制中的作用.方法 采集新疆经典型KS患者血清,提取血清HHV-8病毒DNA作为模板,运用PCR 扩增HHV-8 ORF Kl,以pcDNA3.1/ myc-His(-)A构建真核表达载体,并酶切、测序鉴定,采用不同浓度的重组体及空载体转染不含HHV-8的BJAB细胞,采用Western Blot鉴定HHV-8 K1蛋白的表达,观察细胞形态变化,采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测转染细胞的增殖率.结果 成功构建了pcDNA3.1/HHV-8 K1真核表达载体,HHV-8 K1在BJAB细胞中的表达量随转染重组体浓度的增大而增加,转染重组体组的细胞增殖率高于同浓度下的空载体组,差异有显著性(P均＜0.05).镜下观察,各组细胞形态无显著性差异,但重组体组细胞数量增多明显,生长旺盛.结论 HHV-8 K1可以促进细胞增殖,增殖率的高低与HHV-8 K1的表达量存在一定的关系,K1是HHV-8发挥其致KS机制的一种相关蛋白.     

水通道蛋白3通过调控hnRNPQ/p53延缓皮肤成纤维细胞光老化的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）在皮肤光老化过程中的作用及机制。方法 将正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）分为NHDF组（未转染）、AQP3 cDNA组（转染AQP3 cDNA）、AQP3 siRNA组（转染AQP3 siRNA）、核内不均一核糖核蛋白Q（hnRNPQ）cDNA组（转染hnRNPQ cDNA）、hnRNPQ siRNA组（转染hnRNPQ siRNA）、AQP3-hnRNPQ cDNA组（转染AQP3 cDNA和hnRNPQ cDNA）、AQP3-hnRNPQ siRNA组（转染AQP3和hnRNPQ siRNA）、cDNA空载体组（转染cDNA空载体）、siRNA空载体组（转染siRNA空载体）。用长波紫外线（UVA,10 J·cm-2·d-1）连续照射已经转染或未转染的NHDF 3 d来建立细胞衰老模型,同时以未接受UVA照射的NHDF作为对照。用细胞计数法评估各实验组细胞增殖活性,衰老相关-β半乳糖苷酶染色试剂盒对各实验组进行染色来评估HDF的衰老水平,用荧光素酶报告基因技术检测p53转录调控活性,用Western印迹分析NHDF中AQP3、hnRNPQ及衰老相关蛋白p53、p21的表达水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用ANOVA检验。结果 用UVA连续照射各组NHDF 3 d后,NHDF中p53、p21的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率明显高于未照射的对照组（P＜0.05）,但是AQP3的表达水平和照射后第5、6、7天细胞增殖活性明显低于对照组（P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,AQP3 siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型较siRNA空载体组明显加重,两组间p53、p21、hnRNPQ的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性、细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步沉默hnRNPQ能够逆转上述反应。与siRNA空载体组相比,hnRNPQ siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显减轻,两组间p53、p21表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,cDNA空载体组中p53、p21、hnRNPQ的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为0.56 ± 0.08、0.70 ± 0.07、0.92 ± 0.03、（81.53 ± 7.62）%、7.16 ± 0.25、（2.15 ± 0.23） × 106/ml,而AQP3 cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显轻于cDNA空载体组,其上述指标分别为0.25 ± 0.06、0.23 ± 0.06、0.82 ± 0.09、（31.23 ± 6.54）%、2.52 ± 0.36、（2.93 ± 0.33） × 106/ml,两组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步过表达hnRNPQ能够逆转上述效应。在接受UVA连续照射3 d后,hnRNPQ cDNA组中p53、p21的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为1.41 ± 0.09、1.42 ± 0.06、（91.06 ± 4.24）%、12.35 ± 0.88、（1.23 ± 0.41） × 106/ml,与cDNA空载体组相比,hnRNPQ cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显加重,两组比较,上述指标差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 AQP3可能通过调控hnRNPQ下调p53的表达来减缓UVA诱导的NHDF衰老。     

京尼平苷通过P13K-Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤北大核心CSCD

目的 探讨京尼平苷对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的拮抗作用,以及PI3K-Akt途径在其中的作用。方法 取健康青少年环切术后包皮,分离并培养表皮黑素细胞。取第2 ～ 3代黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、京尼平苷组（125 μmol/L京尼平苷处理）、LY294002组（5 μmol/L LY294002处理）、H2O2组（250 μmol/L H2O2处理）、京尼平苷 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入250 μmol/L H2O2作用4 h）、京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入5 μmol/L LY294002作用1 h,然后用 250 μmol/L H2O2作用4 h）。作用完成后,用噻唑蓝（MTT）法检测黑素细胞增殖活性,Western印迹检测Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、血红素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx-1）蛋白的表达,生物化学方法检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）含量。通过单因素方差分析（ANOVA）对各组间数据进行比较,采用SNK-q检验进行组间两两比较。结果 H2O2组细胞增殖率较对照组明显降低（P 〈 0.01）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.05）蛋白表达水平下降,SOD活性、CAT活性降低（均P 〈 0.01）,ROS含量显著升高（P 〈 0.01）。与H2O2组相比,京尼平苷＋ H2O2组黑素细胞增殖率上升（72.98% ± 8.92%比50.53% ± 10.85%,P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.05）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达上调,SOD［（6.82 ± 1.03） U/mg比（1.29 ± 0.43 ） U/mg,P 〈 0.05］和CAT［（46.08 ± 4.16） U/mg比（18.71 ± 3.09） U/mg,P 〈 0.05］酶活性增高,ROS含量（1 284.33 ± 110.64比2 158 ± 222.75,P 〈 0.01）减少;京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组黑素细胞增殖率（44.35% ± 14.85%）较京尼平苷 ＋ H2O2组降低（P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.05）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达下调,SOD活性［（1.31 ± 0.65） U/mg,P 〈 0.05］和CAT活性［（23.25 ± 5.56） U/mg,P 〈 0.05］减弱,ROS含量增加（1 668 ± 62.03,P 〈 0.05）。结论 京尼平苷可通过PI3K-Akt途径促进黑素细胞HO-1和GPx-1表达,增强SOD和CAT活性,拮抗黑素细胞氧化应激损伤。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的 建立稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）16E7蛋白的HaCaT细胞株。方法 利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HPV16E7。将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定。结果 经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1（+）-HPV16E7成功。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达。结论 成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株。     

Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨自噬标志基因Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响。方法 Western印迹技术检测黑素瘤细胞A375、SK-MEL-2中Beclin1的蛋白表达水平，选取低表达 Beclin1蛋白的SK-MEL-2细胞株作为研究对象，将细胞分为空白组、阴性对照组、实验组，空白组不作处理，阴性对照组转染pcDNA.3.1/myc-His（-）A，实验组转染pcDNA3.1-Beclin1质粒。培养一定时间后，采用CCK8法分析Beclin1对细胞增殖的影响；Transwell实验和细胞划痕实验观察Beclin1过表达对SK-MEL-2细胞侵袭和迁移能力的影响。采用重复测量方差分析和完全随机设计方差分析检验各组间的指标差异，组间比较采用LSD-t检验。结果 SK-MEL-2细胞Beclin1蛋白相对表达水平（0.037 ± 0.010）显著低于A375细胞（0.670 ± 0.150），F = 46.62，P＜0.05。实验组Beclin1蛋白相对表达水平（0.32 ± 0.04）显著高于阴性对照组（0.06 ± 0.02）和空白组（0.07 ± 0.02），均P＜0.05。CCK8实验结果显示，不同组间、不同时间细胞增殖率差异均有统计学意义（F组间 = 1 077.36，F时间 = 4 903.04，均P＜0.05），组别和时间之间有交互作用（F交互 = 205.20，P＜0.05）。Transwell实验显示，24 h后实验组高倍（× 200）视野下穿过小室的细胞数（18.67 ± 1.19）明显低于阴性对照组（87.89 ± 6.05）和空白组（86.78 ± 5.93），均P＜0.05；划痕实验中24、48 h时实验组细胞迁移距离均显著低于空白组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 Beclin1过表达可显著抑制SK-MEL-2细胞的增殖、侵袭和迁移。     

C型凝集素1受体参与人中性粒细胞体外杀伤白念珠菌活性的实验研究

【摘要】 目的 探讨人中性粒细胞能否通过C型凝集素1受体（dectin-1）识别白念珠菌细胞壁不溶性β葡聚糖来介导体外杀伤白念珠菌的活性。 方法 100 mg/L β葡聚糖体外作用于中性粒细胞1、6、24 h后,实时荧光定量逆转录PCR分析dectin-1和Toll样受体2 mRNA表达水平。100 mg/L β葡聚糖体外分别刺激中性粒细胞15 min、2 h、6 h,或先用dectin-1抑制剂昆布多糖100 mg/L和50 mg/L预处理30 min后,再予100 mg/L β葡聚糖刺激2 h,微量培养板荧光分析法检测中性粒细胞H2O2释放水平。昆布多糖预处理的中性粒细胞与白念珠菌体外共培养后,检测菌落形成单位（CFU）。结果 β葡聚糖作用中性粒细胞1、6、24 h后,dectin-1 mRNA水平分别为2.8195 ± 0.1669、5.4859 ± 0.7244、3.6041 ± 0.5372,均明显高于空白对照组（均P < 0.01）。β葡聚糖刺激中性粒细胞15 min后H2O2水平为（64.55 ± 15.67） μmol/L,2 h时为（290.34 ± 30.56） μmol/L,6 h时为（208.54 ± 26.88） μmol/L,与空白对照组（22.05 ± 3.99） μmol/L比较,差异均有统计学意义（均P < 0.01）;100 mg/L和50 mg/L昆布多糖预处理组分别为（80.45 ± 22.41） μmol/L和（130.42 ± 44.55） μmol/L,与β葡聚糖刺激组相比,分别降低了73%和45%,差异均有统计学意义（P < 0.01）。昆布多糖能明显抑制中性粒细胞体外杀伤白念珠菌的活性（均P < 0.01）。 结论 Dectin-1参与人中性粒细胞分泌H2O2以及对白念珠菌杀灭活性,为过继性粒细胞转输治疗系统性念珠菌感染提供初步依据。 【关键词】 念珠菌,白色; 中性白细胞; β葡聚糖类; 外源凝集素类,C型; 过氧化氢     

circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究

【摘要】 目的 初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法 取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织,分离培养成纤维细胞,以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d,建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）,未经处理的正常成纤维细胞作为对照组,β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达,CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达,qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异,并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组：空载组、UVA + 空载组,circIGF2BP3过表达组、UVA + circIGF2BP3过表达组,Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显著高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05,t = 9.49、4.26,P < 0.01、< 0.05）,而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显著低于对照组（100%,t = 7.38,P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04,显著低于对照组（1.00 ± 0.03）,t = 5.46,P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显著低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75,P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显著低于UVA + 空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47,均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平,为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。     

黄芪甲苷对光老化小鼠皮肤中转化生长因子-β信号通路的影响北大核心CSCD

目的探讨黄芪甲苷对皮肤光老化的保护机制。方法BALB／c小鼠分为模型组、模型＋基质组、模型＋黄芪甲苷组、正常对照组。RT—PCR测定转化生长因子β受体Ⅱ（TGF—βRⅡ）、Smad7的mRNA表达水平,免疫组化观察TGF-βRⅡ、Smad7在小鼠皮肤组织中的蛋白表达情况。结果正常对照组中,TGF-βRⅡ、Smad7的灰度值比值分别为0．5688±0．0439、0．5900±0．0585,阳性表达率分别为（53．00±4．72）％、（47．50±3．81）％;模型组中,TGF-βRⅡ、Smad7的灰度值比值分别为0．2588±0．0283、0．8637±0．0514,阳性表达率分别为（28．20±5．24）％、（82．06±2．18）％;模型＋基质组中,TGF-βRⅡ、Smad7的灰度值比值分别为0．2653±0．0456、0．8553±0．0575,阳性表达率分别为（28．74±2．28）％、（82．62±4．02）％;模型＋黄芪甲苷组中TGF-βRⅡ、Smad7的灰度值比值分别为O．3767±0．0374、0．7131±0．0410,阳性表达率分别为：（41．64±2．59）％、（64．36±2．62）％。皮肤组织中TGF-βRⅡ和Smad灰度值比值4组小鼠间比较,F值分别为80．98和736．80,TGF-βRⅡ和Smad7的阳性表达率4组小鼠间比较,F值分别为45．36和132．25,P值均〈0．01。与正常对照组相比,模型组TGF-βRⅡmRNA和蛋白表达明显降低,Smad7mRNA和蛋白表达显著升高（P值均〈0．01）。与模型组和模型＋基质组比较,模型＋黄芪甲苷组TGF-βRⅡmRNA和蛋白表达明显升高,Smad7mRNA和蛋白表达显著下调（P值均〈0．01）。模型＋基质组TGF-βRⅡ、Smad7的mRNA和蛋白表达与模型组相比差异无统计学意义（P值均〉0．01）。结论黄芪甲苷可以通过上调TGF-βRⅡ表达和下调Smad7表达而改变TGF—β通路的信号转导参与抗光老化。     

柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线照射后体外培养人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及机制研究

目的：研究柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线（UVB）照射后体外培养人皮肤成纤维细胞（HSF）衰老的保护作用及衰老相关基因p53、p21、微RNA(miR)-34c和沉默信息相关调节因子（SIRT）1 mRNA表达水平的影响。方法：取对数生长期的HSF，分为对照组、UVB照射组，柴达木黑果枸杞花青素低剂量组（0.1 g/L）、柴达木黑果枸杞花青素中剂量组（0.5 g/L）和柴达木黑果枸杞花青素高剂量组（1.0 g/L）。UVB照射前24 h用不同浓度的柴达木黑果枸杞花青素预处理HSF。UVB照射后72 h,β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法检测衰老细胞比例，定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测细胞中衰老相关基因p53、p21、miR-34c及SIRT1 mRNA的表达水平。结果：与对照组相比，UVB照射组细胞SA-β-gal染色阳性率及p53、p21、miR-34c和SIRT1 mRNA表达水平均升高（P<0.05）。与UVB照射组相比，柴达木黑果枸杞花青素（0.1 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L）组细胞SA-β-gal染色阳性率，p53、p21、miR-3...     

咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的 探讨咖啡酸衍生物WSY6对过氧化氢（H2O2）诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用和潜在分子机制。方法 体外培养原代人表皮黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（1 mmol/L H2O2处理）和6.25、12.5、25 μmol/LWSY6组（分别用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6预处理1 h后再用1 mmol/L H2O2处理1 h）。继续培养24 h后,用MTS法测定黑素细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测LDH释放量。部分黑素细胞分为抑制剂组（用p38抑制剂预处理1 h,再用1 mmol/L H2O2处理1 h）和H2O2组（直接用1 mmol/L H2O2处理1 h）,处理完成后继续培养24 h,用试剂盒检测LDH的释放量。部分黑素细胞用25 μmol/L WSY6预处理1、2、4 h后,再用H2O2处理1 h,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平;部分黑素细胞用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6处理1 h后,再用H2O2处理1 h,Western印迹法检测细胞色素C（cyto?c）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）、caspase?9和磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶（p?p38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（p?ERK）及c?Jun氨基末端激酶（p?JNK）的表达。结果 与对照组相比,H2O2组黑素细胞存活率明显降低（29.22% ± 1.31%,P < 0.05）,细胞内LDH释放量增加（47.19% ± 4.85%,P < 0.05）,ROS水平明显升高（18.37 ± 1.59,P < 0.05）,caspase?3和caspase?9的表达亦均升高。与H2O2组相比,6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组细胞存活率明显增加（52.48% ± 1.17%、60.21% ± 0.25%、78.32% ± 1.73%,P < 0.05）,LDH释放量明显下降（21.99% ± 0.22%、15.38% ± 0.45%、13.18% ± 0.38%,均P < 0.05）,25 μmol/L WSY6处理1、2、4 h组细胞内ROS显著下降（7.59 ± 1.00、6.22 ± 0.52、5.15 ± 0.48,均P < 0.05）。同时p38抑制剂组黑素细胞LDH释放量较H2O2组显著下降（P < 0.05）。Western印迹法显示,WSY6预处理后,与H2O2组相比,caspase?3和caspase?9表达明显降低,p?p38表达下降,但p?ERK和p?JNK表达无明显变化;同时WSY6组p38 MAPK下游产物p?p53表达也下降,且WSY6浓度越高,下降越明显。结论 WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,可能通过p38 MAPK途径发挥作用。     

马尾松针提取物通过核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件通路对人毛乳头细胞氧化应激损伤保护作用的研究

【摘要】 目的 探讨马尾松针提取物（PMNE）对人毛乳头细胞（HDPC）抗氧化应激的保护作用及机制。方法 以HDPC为研究对象,分别采用0（对照组）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L H2O2处理HDPC,建立体外HDPC氧化应激的最佳条件;在HDPC中转染核因子E2相关因子2（Nrf2）干扰片段siRNA1、siRNA2、siRNA3或过表达质粒pCMV6-XL5-Nrf2,实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测Nrf2 mRNA及蛋白的表达;H2O2条件下检测转染后各组细胞活性及凋亡率。常规培养HDPC并分组处理,对照组：正常培养,不予其他处理;双氢睾酮组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮;原花青素组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮和6.00 μg/ml原花青素B2处理;不同浓度PMNE组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮培养液,同时分别给予1、5、25、100 μg/ml PMNE处理;分别检测各组细胞活性及凋亡率、细胞内活性氧（ROS）相对荧光强度和丙二醛（MDA）含量,Nrf2、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HO-1）、Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）、转化生长因子（TGF）-β1、Sma和Mad相关蛋白2/3（Smad2/3）、p-Smad2/3的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HDPC细胞活力为75% ~ 85%时,选择0.4 mmol/L H2O2作为体外HDPC氧化应激最适处理浓度。Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著低于空白组和对照组（均P < 0.05）,细胞凋亡率（12.50% ± 0.05%、26.07% ± 0.05%、58.44% ± 1.03%）均显著高于空白组（10.38% ± 0.64%）和对照组（13.05% ± 0.12%）,均P < 0.05。Nrf2-siRNA2组的Nrf2蛋白表达量最低,选择Nrf2-siRNA2为最佳干扰片段进行后续实验。Nrf2过表达组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组和对照组（均P < 0.05）,其细胞凋亡率明显低于空白组和对照组（均P < 0.05）。0.4 mmol/L H2O2处理条件下,Nrf2过表达组细胞凋亡率显著低于过表达空载组（t = 3.66,P < 0.001）,细胞活性高于过表达空载组（t = 40.40,P < 0.001）;Nrf2-siRNA2组细胞凋亡率显著高于对照组（t = 13.13,P < 0.001）,而细胞活性显著低于对照组（t = 67.37,P < 0.001）。PMNE处理实验中,原花青素组和不同浓度PMNE组细胞活性均显著高于双氢睾酮组（均P < 0.01）,而细胞凋亡率显著低于双氢睾酮组（均P < 0.01）;原花青素和不同浓度PMNE均能显著抑制双氢睾酮诱导的HDPC细胞内ROS和MDA的过度表达（均P < 0.01）;原花青素组和5、25、100 μg/ml PMNE组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达显著高于双氢睾酮组（均P < 0.05）,原花青素组和25、100 μg/ml PMNE组Keap1、TGF-β1蛋白表达及Smad2/3磷酸化水平显著低于双氢睾酮组（均P < 0.05）。结论 Nrf2在抵抗HDPC的氧化应激损伤中起重要作用,PMNE可能通过激活Nrf2抗氧化反应元件通路而对HDPC产生明显的保护作用。     

N-乙酰半胱氨酸对PM2.5诱导肥大细胞活化作用的影响

目的：明确N-乙酰半胱氨酸（NAC）对颗粒物PM_2.5诱导肥大细胞P815活化作用的影响。方法：用100 μg/mL PM_2.5刺激肥大细胞建立脱颗粒模型，设空白组，模型组，不同浓度NAC组（浓度分为100，50，25 μmol/L）；不同浓度NAC处理肥大细胞6 h后，再以 PM_2.5刺激6 h，CCK-8法测定细胞增殖活性，酶标仪测定活性氧（ROS）水平及β-氨基己糖苷酶（β-Hex）水平、ELISA检测IL-4水平，Western blot检测蛋白酶激活受体2（PAR2）蛋白表达水平。结果：与空白组比较，模型组ROS、β-Hex、IL-4含量及PAR2蛋白表达显著增高（均P＜0.05）；与模型组比较，NAC组肥大细胞ROS、β-Hex、IL-4含量及PAR2蛋白表达水平降低（均P＜0.05），其中50 μmol/L NAC组降低最明显。结论：NAC可降低肥大细胞氧化应激，抑制PAR2蛋白表达，减少炎症介质释放。     

全反式维A酸对恶性黑素瘤A375细胞上皮-间质转化相关分子表达的影响

【摘要】 目的 研究全反式维A酸（ATRA）对人恶性黑素瘤A375细胞中上皮-间质转化（EMT）相关分子表达的影响。方法 用含10 μmol/L ATRA的DMEM培养基和DMEM培养基分别处理A375细胞24和48 h作为ATRA-1组和ATRA-2组、对照1组和对照2组,采用实时定量PCR法检测EMT相关基因上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达。Western印迹法检测ATRA-1组、ATRA-2组、对照1组中上述蛋白的相对表达量,直接免疫荧光法检测上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的荧光强度。统计分析采用两因素方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验。结果 ATRA-1组和ATRA-2组分别与对照1组和对照2组相比,上皮钙黏着蛋白mRNA的表达均显著增加（F = 13.148、31.529,P < 0.05）,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达均显著降低（均P < 0.05）;ATRA-2组上皮钙黏着蛋白mRNA的表达显著高于ATRA-1组（F = 13.148,P < 0.05）,而其他3种蛋白mRNA的表达显著低于ATRA-1组（均P < 0.05）;对照1组与对照2组上述蛋白的mRNA表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹法显示,与对照1组相比,ATRA-1组和ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达均下调（均P < 0.05）;与ATRA-1组相比,ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调（P < 0.05）,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达下调（均P < 0.05）。直接免疫荧光显示,ATRA-1组、ATRA-2组上皮钙黏着蛋白的荧光强度（6.23 ± 0.08、10.37 ± 0.13）显著高于对照1组（2.37 ± 0.14,均P < 0.05）,而波形蛋白的荧光强度（15.17 ± 0.18、10.29 ± 0.03）显著低于对照1组（50.16 ± 0.26,均P < 0.05）,抑制上皮向间质转化。结论 ATRA可上调A375细胞中上皮钙黏着蛋白的表达,降低神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达,可能抑制A375细胞发生EMT现象。     

氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中β-连环蛋白的表达研究

目的 观察β-连环蛋白在氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中的变化,探讨其在应激诱导的皮肤衰老中可能的作用.方法 从儿童包皮分离培养原代成纤维细胞,H2O2:处理第2～4代人皮肤成纤维细胞,显微镜观察其形态学改变,β-半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性,RT-PCR、Western印迹检测β连环蛋白mRNA和蛋白表达水平.结果 150 μmol/L H2O2:处理2 h后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老.在应激诱导的衰老(SIPS)细胞中β-半乳糖苷酶阳性率达到(37.67±1.53)%.而对照细胞中只有(2.97±0.25)%,两组差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR 结果显示,在对照细胞组β连环蛋白/GAPDH mRNA比值为0.59±0.04,SIPS细胞组为0.29±0.30,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义(t=10.06,P<0.01).Western印迹结果显示,对照细胞组β连环蛋白/GAPDH蛋白比值为0.62±0.03,SIPS细胞组为0.31±0.01,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义(t=14.97,P<0.0).结论 150 μmol/L H2O2:处理2 h可以诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老改变,SIPS细胞中β连环蛋白表达水平明显降低,初步推测β连环蛋白可能是调控皮肤衰老的重要靶基因.

Abstract：

Objective To observe the changes of β-catenin expression in human skin fibroblasts (HSFs) after induced by oxidative stress, and to explore its possible roles in oxidative stress-induced premature senescence (SIPS) of HSFs. Methods Fibroblasts were isolated from the foreskin of a child and subjected to a primary culture. The fibroblasts of second to fourth passage were treated with various concentrations of H2O2 for 2 hours to establish an optimized model of stress-induced premature senescence, β-galactosidase assay kit was used to detect the activity of β-galactosidase in H2O2rinduced HSFs, RT-PCR and Western blot to measure the mRNA and protein expressions of β-catenin in control and senescent HSFs. Results Premature senescence of HSFs could be induced by the treatment with H2O2 of 150 μmol/L for 2 hours. The proportion of β-galactosidase-positive cells was (2.97 ± 0.25)% in control HSFs and (37.67 ± 1.53)% in senescent HSFs (P< 0.01). A significant increase was observed in the β-catenin/GAPDH protein ratio and β-catenin/GAPDH mRNA ratio in control HSFs compared with the senescent HSFs (0.62 ± 0.03 vs. 0.31 ± 0.01, t = 14.97, P < 0.01; 0.59 ± 0.04 vs. 0.29 ± 0.30, t = 10.06, P < 0.01). Conclusions The two-hour treatment with H2O2 of 150 μmol/L could induce the premature senescence of HSFs, and there is a notable decrease in the expression of β-catenin in prematurely senescent HSFs induced by oxidative stress, implying that β-catenin is an important target gene for the regulation of skin aging.