靶向c-Met的shRNA重组质粒的构建及生物活性鉴定

目的设计以人c-Met基因为靶向的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制c-Met mRNA及蛋白表达的效应,筛选RNAi作用最强的shRNA片段。方法设计3对针对c-Met基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA的重组质粒pSilencer 2.0/c-Met-shRNA,通过脂质体介导的方法将其转染到喉癌Hep-2细胞株中。采用RT-PCR及Western-Blot法检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达的变化,判断各shRNA的干扰效应。结果经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western-Blot法检测,转染干扰质粒后,c-Met基因的mRNA水平及蛋白表达水平均下调,以重组质粒pSilencer 2.0/c-Met-sh RNA2效应最显著。结论成功构建了针对c-Met基因的重组RNAi质粒,为下一步探讨c-Met基因对喉癌Hep-2细胞的生物学行为的作用奠定了基础。     

CD44基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建CD44基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并在下咽癌FaDu细胞株上鉴定其沉默效率,为研究目的基因沉默后下咽癌肿瘤细胞致瘤性的改变提供稳定可靠的载体。方法针对目的基因CD44mRNA的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计、合成4个CD44基因特异性小分子干扰iRNA（small interference RNA,siRNA）靶点,将其合成短发卡hRNA（short hairpin RNA,shRNA）并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获取正确克隆。将筛选出的最有效重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其感染下咽癌FaDu细胞株细胞,采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果对LV-CD44-shRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入序列正确,CD44基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度为8E＋8TU/ml。RNA干扰下咽癌FaDu细胞CD44基因后,CD44 mRNA水平显著下降,干扰效率大于70%。结论成功构建了CD44基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因,为CD44基因沉默后下咽癌肿瘤细胞生物学改变的研究打下了较坚实的基础。     

腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1基因表达

目的构建针对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP-1)的特异性发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰序列的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体(rAAV-shRNA- LMP-1),介导其体外表达并鉴定其生物活性。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性shRNA干扰序列,采用分子克隆的方法,将干扰序列及U6启动子插入pAAV-2质粒中,采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-shRNA-LMP-1,测定其滴度及感染效率,RT- PCR鉴定目的基因的抑制效率。结果以rAAV-EGFP 5×10~4v．g(Virus genome,病毒基因组数),细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,PT-PCR鉴定rAAV- shRNA-LMP-1以5×10~4v．g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,为进一步研究肿瘤基因治疗,尤其是动物实验奠定了基础。     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

RNAi沉默TRF2基因对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的影响

目的:探讨采用RNA干扰技术沉默端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的作用情况.方法:构建特异性表达TRF2 mRNA且含有荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA,并将其转染Hep-2细胞,采取PCR琼脂糖凝胶电泳检验靶基因TRF2表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,cell counting kit-8(CCK-8)法观察细胞增殖活性.结果:Hep-2细胞被转染后,TRF2基因表达明显受抑,细胞凋亡发生,增殖活性明显降低.结论:RNA沉默TRF2可明显抑制人喉鳞状癌细胞的增殖,促进细胞发生凋亡.     

Jab1靶向shRNA质粒构建及其对Hep-2细胞目的基因沉默效应

目的 利用RNA干扰技术构建Jab1基因靶向shRNA质粒,观察目的 基因沉默效应及对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)的影响.方法 设计合成以Jab1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆到真核表达载体pGenesill.1中形成重组质粒,利用脂质体介导的方法将质粒转染至Hep-2细胞,通过W...     

RNA干扰及其在喉鳞癌研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指一种双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在Mrna(messenger RNA)水平关闭相应序列基因的表达后,使其沉默或表达下调,从而达到抑制某种特定基因表达的目的,是一种序列特异性的转录后基因沉默[1].     

鸡耳蜗EFNA2基因RNAi慢病毒载体的构建及其靶基因离体沉默效率

目的构建鸡耳蜗EFNA2基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,在离体培养原代鸡听神经细胞中鉴定其沉默效率。方法针对鸡EFNA2基因序列设计特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点,构建慢病毒pFU-GW-iRNA载体,将筛选所得有效短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体在293T细胞中包装成病毒颗粒,随后将其感染离体培养原代鸡听神经细胞,最后采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果 PCR克隆鉴定及测序结果显示所构建的shRNA慢病毒载体正确无误,包装病毒后的滴度为2.0×109 TU/ml,分别命名为LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2和LV-GFP-EF-NA2-shRNA-3。ShRNA慢病毒颗粒感染目的细胞后,EFNA2基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了76.11%、61.87%和68.44%。结论本研究成功构建了鸡EFNA2基因的RNAi慢病毒表达载体,并能在离体培养的原代鸡听神经细胞中有效沉默靶基因。     

RNA干涉鼻咽癌细胞Raf-1基因表达的实验研究

目的 研究应用载体介导的RNA干涉技术特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞株HNE1中的表达以及对其生物学行为的影响。方法 构建利用U6启动子转录功能的shRNA的载体，在U6启动子下游分别插入含针对Raf-1基因不同位点的特异性RNA干扰序列-67bp寡核苷酸片段，并编号命名为：pshuttle-Raf-1-a（225），pshattle-Raf-1-b（358）和pshuttle—Raf-1-c（474）。将构建的质粒通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株HNE1，用RT—PCR分析Raf-1基因的mRNA的表达，流式细胞仪检测转染后HNE1细胞的凋亡率。结果 3种含有针对Raf-1基因不同特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在HNE1细胞中的表达，其中以pSIREN shuttle-Raf-1-b（358）作用最为明显。RT-PCR检测Raf-1基因mRNA表达量下降，流式细胞仪检测细胞凋亡率增加，达到65％。结论 应用载体介导的RNAi技术可特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞HNE1中的表达，使该细胞凋亡率增加，Raf-1基因相对应的mRNA表达下降。     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

MDR1基因RNA干扰逆转喉癌细胞多药耐药性的研究

目的采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术通过敲减MDR1基因编码的P糖蛋白的表达,逆转人喉癌耐药细胞系（LSC-1,WⅨ）对于化疗药物的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）。方法采用表达MDR1shRNA（smallhairpinRNA）的慢病毒载体转染LSC-1/TAX细胞,干扰MDR1mRNA。体外MTT实验观察其对各种化疗药物敏感性,裸鼠荷瘤试验在体检测其对TAX的敏感性,通过免疫组化方法在蛋白水平检测体内外细胞中MDR1基因的表达。结果体外逆转LSC-1／TAX喉癌细胞对多种化疗药物的MDR,裸鼠荷瘤试验显示细胞化疗药物的敏感性被成功回复。免疫组化方法证实MDR1shRNA可以在体内外有效地敲减MDRl基因的表达。结论表达MDR1shRNA的慢病毒载体可以在转录后明显降低MDR1基因的表达,从而提高喉癌细胞对常用化疗药物的敏感性。     

Short hairpin RNA system to inhibit human p16 in squamous cell carcinoma

OBJECTIVE: To develop short hairpin RNA (shRNA) vectors and virions to trigger RNA interference against human p16. DESIGN AND INTERVENTIONS: A modular vector-based shRNA system was used to construct multiple distinct shRNA vectors against the unique exon 1alphaof p16. Target sequences were designed using rigid criteria for length and GC content, along with basic local alignment search tool (BLAST) evaluation to ensure targeting specificity. Individual shRNA-p16 cassettes were then cotransfected with a p16 expression vector and evaluated by Western blot. Cassettes showing a high level of p16 repression were used to construct shRNA-p16 expressing adenoviral and retroviral vectors and tested in a human head and neck squamous cell carcinoma line expressing endogenous and exogenous p16. RESULTS: Adenoviral and retroviral transfer of shRNA-p16 significantly reduced p16 protein levels, while control constructs left p16 expression unchanged. CONCLUSIONS: Although p16 is a common target of inactivation in head and neck cancer, its biological role remains ill defined. RNA interference is rapidly becoming the standard to target selected genes of interest for inactivation. We have successfully inhibited p16 expression using shRNA cassettes with strong activity against human p16 and integrated these constructs into adenoviral and retroviral vectors for transient and integrated expression in human cells. Application of this novel modular system to primary human cells will allow the biological consequences of p16 loss to be examined both in vitro and in vivo.