肺癌的自杀基因放射导向治疗实验研究

目的：利用放射敏感性调控序列诱导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的肿瘤靶向表达，以提高肺癌自杀基因治疗的选择性和有效性。方法：利用基因重组构建放射可调控的HSV－TK表达载体；转染肺癌A549细胞系，观察γ线照射后细胞HSV－TK表达，以及丙氧鸟苷（GCV）作用下细胞相对存活率的变化。利用裸鼠肺癌模型观察不同处理后的抑瘤效应。结果：γ线可诱导HSV－TK在被转染肺癌细胞表达显增强，呈剂量依赖性；经放射诱导后，转染细胞对GCV的敏感性明显升高（P＜0．05），细胞生工活性显受抑；放射联合GCV可明显抑制感染tgEgr-HyTK的裸鼠移植瘤，并可使50％的肿瘤完全消退。结论：由辐射敏感性启动子诱导的自杀基因肿瘤靶向性表达，是一种高产、安全的肺癌基因治疗新策略。     

乏氧／辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响

目的 构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察其对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响.方法 利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,MTT法检测A549细胞增殖的变化,流式细胞术检测A549细胞周期的变化.结果 BamH I和Sma I酶切,所得片段大小分别为1 284 bp和4 998 bp、2 292 bp和3 990 bp;以载体为模板,Egr1和shTRAIL引物进行PCR扩增,可得到469 bp和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确.转染肺腺癌A549细胞后,乏氧与辐射能够降低细胞增殖能力,增加G0/G1和S期细胞百分比,降低G2/M期细胞百分比(P＜0.05,P＜0.01),二者联合作用更明显.结论 乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因在乏氧和/或辐射条件下能够延长细胞G0/G1和S期,缩短G2/M期,并且抑制肺腺癌A549细胞增殖能力,二者协同作用更明显.     

Cx43基因修饰对大肠癌细胞的放射增敏作用

目的通过重组质粒pBudCE4.1-Cx43转染人大肠癌SW480细胞,探讨Cx43基因修饰对大肠癌SW480放射增敏性的影响。方法用Lipofectamine TM2000转染的方法将重组表达质粒pBudCE4.1-Cx43转染入大肠癌SW480细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测Cx43在转染后的mRNA和蛋白的表达情况,转染48 h后,分别测定各个处理组细胞Cx43 mRNA水平及其蛋白表达水平,划痕染料示踪法检测细胞间通讯功能。各组细胞分别接受不同剂量6 MV X射线照射,通过集落形成实验检测细胞放射敏感性,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。每组实验重复3次。通过构建人大肠癌裸鼠移植瘤模型,观察10 Gy照射后肿瘤生长状况,并检测其Bcl-2基因活性。结果 Cx43 mRNA和蛋白表达,转染组与阴性对照组和空白组相比显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。细胞传递的荧光强度,转染组与阴性对照组和空白组相比亦显著升高,差异有统计学意义(P0.01),与阴性组和空白对照相比,经过射线放射处理后,转染组细胞的增殖能力显著降低(P0.05);经过0～8 Gy射线处理后细胞克隆形成的能力明显下降(P0.05);10 Gy照后,转染组凋亡率为(19.86±1.53)%,明显高于阴性对照组[(6.75±1.20)%]和空白组[(6.90±1.17)%,P0.05];同时射线处理后移植瘤生长受到显著抑制作用;移植瘤细胞的Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论转染Cx43基因能够提高人大肠癌SW480细胞对X射线的敏感性,概系因降低了细胞Bcl-2的基因表达使然。     

双向调控FABP-5表达对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的经过临床病理学标本检测人卵巢癌组织表皮型脂肪酸结合蛋白(FABP)-5蛋白异常高表达后,探讨上调和下调FABP-5基因表达对卵巢癌细胞株SKOV3细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测30例卵巢癌及癌旁组织中FABP-5 mRNA和蛋白表达水平,通过电穿孔法分别将FABP-5 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FABP-5转染卵巢癌SKOV3细胞后,G418筛选得到稳定转染细胞系。转染48 h后采用RT-PCR和Western印迹行细胞中FABP-5 mRNA和蛋白检测,细胞计数试剂盒(CCK)-8检测细胞增殖,克隆形成实验观察上调和下调FABP-5表达对卵巢癌细胞株SKOV3的放射敏感性的影响,末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;裸鼠移植瘤实验检测调节FABP-5表达联合X射线照射对卵巢癌细胞的影响。结果 FABP-5蛋白在人卵巢癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05),FABP-5下调组SKOV3细胞FABP-5基因水平明显降低(P<0.05),FABP-5上调组明显升高(P<0.05)。FABP-5下调组SKOV3细胞放射敏感性显著升高(P<0.05),FABP-5上调组SKOV3细胞放射敏感性显著降低(P<0.05)。FABP-5下调组SKOV3细胞增殖被显著抑制,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);FABP-5上调组SKOV3细胞凋亡率显著降低(P<0.05),FABP-5下调组较对照组裸鼠移植瘤平均体积明显缩小(P<0.05);FABP-5上调组较对照组裸鼠移植瘤平均体积明显增大(P<0.05)。20 Gy X射线照射后FABP-5下调组瘤体平均体积较照射前明显减小(P<0.05);而上调组裸鼠种植瘤平均体积较照射前变化不大(P>0.05)。结论下调FABP-5表达能抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤的生长,增强瘤体的放射敏感性,上调FABP-5表达则使肿瘤辐射抗拒。     

缺氧诱导热休克蛋白70-2表达的分子机制

目的 观察缺氧对HepG32细胞中热休克蛋白(HSP)70-2(基因名为HSPA2)表达的影响,探讨缺氧条件下缺氧诱导因子(HIF)-1在转录水平调控HSP70-2表达的具体机制. 方法 以物理缺氧法和化学缺氧诱导剂(DFO或CoC12)诱导法分别模拟肿瘤缺氧环境,Western blot检测HIF-1α和HSP70-2蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因分析技术检测缺氧对HSPA2基因的激活作用.HIF-1α抑制剂(YC-1)或HIF-1α小干扰RNA(siRNA)处理后检测缺氧HepG2细胞中HSP70-2的表达变化.构建一系列截短和突变的HSPA2基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与HIF-1α siRNA共转染HepG2细胞,荧光素酶分析技术检测HSPA2启动子活性的变化,寻找HIF-1在HSPA2启动子上的结合位点.各组间比较用方差分析,两组间比较用t检验. 结果 缺氧培养6 h后,HepG2细胞中HIF-1α和HSP70-2表达增加,其表达量随着缺氧培养时间的延长而逐渐增加(F=77.369,P<0.01;F=108.854,P<0.01).各组分别加终浓度为0、50、100 μmol/L的化学缺氧诱导剂DFO或终浓度为0、100、200 μmol/L的CoCl2,培养24 h后检测,随着DFO浓度增加,HIF-1α和HSP70-2蛋白表达逐渐增加(F=443.174,P<0.01;F=589.238,P<0.01);随着COCl2浓度增加,HIF-1 α和HSP70-2蛋白表达也逐渐增加(F=637.724,P<0.01;F=692.918,P<0.01).与常氧培养相比,缺氧培养后HSPA2启动子活性增加7.09倍(t=43.551,P<0.01).随着YC-1浓度升高,HIF-1α表达受到明显抑制(F=883.614,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=218.112,P<0.01).转染HIF-1α siRNA后HIF-1α表达受到明显抑制(F=577.130,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=465.598,P<0.01).构建系列截短的HSPA2启动子报告基因载体转染HepG2细胞后检测,转染HSPA2(-1114/+62)-LUC和HSPA2(-653/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性无明显改变,但转染HSPA2(-385/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性较前明显降低(t=13.717,P<0.01).分别构建突变缺氧反应元件(HRE)1和HRE2的HSPA2启动子报告基因载体,转染HepG2细胞后检测,突变HRE1后HSPA2启动子活性显著降低(t=10.954,P<0.01),但是突变HRE2后HSPA2启动子活性无明显改变.结论 缺氧显著上调HepG2细胞中HSP70-2的表达,其机制可能是HIF-1与HSPA2启动子上HRE1结合后激活该基因的转录.     

低氧反应元件对大鼠骨骼肌成肌细胞转染表达血管内皮生长因子基因的调控作用

目的:研究低氧反应元件(HRE)对血管内皮生长因子(VEGF)基因121在原代培养大鼠骨骼肌成肌细胞中转染表达的调控作用。方法:利用分子生物学方法,构建pEGFP-C3-9HRE-CMV-VEGF121载体,通过脂质体介导将其转染到原代培养的大鼠骨骼肌成肌细胞中。在不同低氧浓度及不同缺氧时间下培养,通过RT-PCR、Western-Blot及荧光显微镜检测转基因成肌细胞的基因表达情况。结果:低氧浓度组可见明显目的基因条带,且随着氧浓度的降低及缺氧时间的延长,目的基因表达增强;低氧环境下,转染后的成肌细胞表达VEGF121蛋白产物明显增加;低氧环境下可见报告基因EGFP表达,常氧环境下未见报告基因表达。结论:以多拷贝HRE构建低氧启动子插入VEGF基因上游,可作为控制VEGF基因表达的开关,这对于防止VEGF基因转染的成肌细胞移植后VEGF基因过度表达所引起的安全问题,提高基因治疗的安全性有重要意义。     

BAG-1基因沉默对非小细胞肺癌放射敏感性的影响及机制

目的探讨BAG-1基因与非小细胞肺癌放射敏感性的关系,为非小细胞肺癌个体化治疗提供理论依据。方法对A549肺腺癌细胞、H460大细胞癌及NCL-H520鳞癌细胞三株非小细胞肺癌细胞株及人胚肾细胞株HEK293行细胞放射敏感性试验,采用Western blot法检测各细胞株中BAG-1蛋白表达情况。选择其中对放射线相对较抗拒、BAG-1蛋白表达最高的A549细胞株,构建干扰载体pGCsi-BAG-1并筛选BAG-1基因沉默细胞株,用shRNA-2转染,酶标仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,放射敏感性试验观察细胞对放射线的敏感性。结果 shRNA-2转染的细胞株生长受到抑制,且随时间延长抑制作用明显,而阴性对照质粒转染的A549细胞株生长无明显变化;6 Gy射线照射后24 h,shRNA-2转染细胞凋亡率为(49.6±4.23)%,未转染的A549细胞为(15.3±2.11)%,阴性对照质粒转染细胞为(14.8±3.55)%,shRNA-2转染细胞凋亡率较未转染细胞增加了3.2倍(P<0.01),而阴性对照转染细胞与未转染细胞间相比差异无统计学意义;亲本A549细胞和阴性对照转染细胞之间的放射敏感性无差异(P>0.05)。而shRNA-2转染细胞的放射敏感性明显增加,与前二者比较差异有显著性(P<0.05)。结论 BAG-1基因沉默可增强非小细胞肺癌放射敏感性,可能机制为BAG-1基因沉默后抑制细胞生长,抗凋亡作用减弱,细胞内BAG-1分布发生改变,细胞对射线更敏感。     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Trail基因体外表达及意义

目的探讨不同辐射剂量X射线照射对转染重组腺病毒（Ad-Egr-hTrail）的胶质瘤U251细胞hTrailmRNA表达的影响。方法扩增Ad-Egr-hTrail。将扩增鉴定成功的Ad-Egr-hTrail感染U251细胞,感染48 h后分别予0、2、5、8、10、12、15、18 Gy X射线照射,real-time quanitative-PCR法测定不同剂量照射后肿瘤细胞中Trail mRNA表达。结果 U251细胞TrailmRNA表达水平照射后1 h开始升高,4~8 h维持在较高表达水平,照射后4 h表达水平最高,随后开始下降;随照射剂量增加,Trail mRNA表达水平明显增加,12 Gy时达到最高水平,然后随照射剂量增加,表达水平开始下降。结论重组腺病毒经射线诱导Egr-1基因启动子能够调控Trail基因体外表达,Trail基因表达量与放射剂量及放射后间隔时间有关。     

低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCI-H446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响

目的探讨低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCIH446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响。方法对荷人小细胞肺癌裸小鼠进行全身深部X射线照射,采用TUNEL(末端脱氧核甘酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)检测荷人小细胞肺癌裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡的情况。结果D1组(75mGy)照射后,细胞凋亡指数(AI)呈增加趋势,但与假照组(0mGy)比差异不显著(P>0.05)。D2组(4Gy)、D1+D2组细胞凋亡指数均明显增加,与假照组(0mGy)比差异显著(P<0.010。而D1+D2组与D2组比较,D1+D2组细胞凋亡指数增加更为明显,有统计学差异(P<0.05)。结论75mGy照射对小细胞肺癌可能有一定的促细胞凋亡作用;大剂量照射及低剂量联合大剂量照射对小细胞肺癌均有促细胞凋亡作用,低剂量辐射与大剂量辐射有协同促小细胞肺癌细胞凋亡的作用。     

人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型的建立

目的建立稳定的人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型并观察其生长特性,为解决鼻咽癌放射抗拒提供良好的动物模型。方法将人鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R、人鼻咽癌细胞CNE-2分别注入裸鼠左右后肢皮下。移植瘤生长后,隔日测量肿瘤直径,计算肿瘤体积,绘制移植瘤体积生长曲线。肿瘤直径0.8～1 cm时以X线隔日照射移植瘤,1 600 Gy分4次。计算移植瘤体积倍增时间和体积增长率。照射后2周取出移植瘤行常规病理检查,免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果 CNE-2R、CNE-2细胞的皮下成瘤率均为100%,建模成功。相对于CNE-2移植瘤,CNE-2R移植瘤生长速度慢,生长受照射抑制不明显;PCNA表达较低。结论相对于CNE-2移植瘤,CNE-2R移植瘤具有更强的放射抗拒性,CNE-2R裸鼠移植瘤模型是进一步研究鼻咽癌放射抗拒的有力工具。     

缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR表达的影响及其调控机制

背景：缺氧是实体瘤微环境的基本特征之一。人宫颈癌基因（HCCR）是新近发现的一种癌基因．在多种人类肿瘤中过表达。然而，尚缺乏HCCR在肿瘤缺氧环境中的表达及其调控机制的研究。目的：探讨缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR表达的影响及其调控机制。方法：SMMC7721细胞分别接受缺氧培养以及LY294002（P13K特异性抑制剂）和PD98059（MEK1特异性抑制剂）预处理＋缺氧培养，以蛋白质印迹法检测HCCR表达：将含HCCR启动子片段的荧光素酶报告基因质粒转染SMMC7721细胞，检测缺氧对HCCR启动子转录活性的影响。结果：缺氧环境下SMMC7721细胞中HCCR蛋白表达和转录活性均较常氧环境中升高，LY294002和PD98059可抑制缺氧环境下HCCR蛋白表达。结论：缺氧状态下人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR蛋白表达和启动子转录活性增高。可能是肿瘤细胞在缺氧实体瘤组织中存活和快速增殖的重要机制之一。缺氧状态下HCCR蛋白表达受P13K／Akt和MAPK这两条信号通路的调节。     

Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia response element-regulated gene expression in mouse ischemic heart model

Intramyocardial injection of genes encoding angiogenic factors could provide a useful approach for the treatment of ischemic heart disease. However, uncontrolled expression of angiogenic factors in vivo may cause some unwanted side effects, such as hemangioma formation, retinopathy, and arthritis. It may also induce occult tumor growth and artherosclerotic plaque progression. Because hypoxia-inducible factor 1 is up-regulated in a variety of hypoxic conditions and it regulates gene expression by binding to a cis-acting hypoxia-responsive element (HRE), we propose to use HRE, found in the 3' end of the erythropoietin gene to control gene expression in ischemic myocardium. A concatemer of nine copies of the consensus sequence of HRE isolated from the erythropoietin enhancer was used to mediate hypoxia induction. We constructed two adeno-associated viral vectors in which LacZ and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions were controlled by this HRE concatemer and a minimal simian virus 40 promoter. Both LacZ and VEGF expression were induced by hypoxia and/or anoxia in several cell lines transduced with these vectors. The functions of these vectors in ischemic myocardium were tested by injecting them into normal and ischemic mouse myocardium created by occlusion of the left anterior descending coronary artery. The expression of LacZ gene was induced eight times and of VEGF 20 times in ischemic myocardium compared with normal myocardium after the viral vector transduction. Hence, HRE is a good candidate for the control of angiogenic factor gene expression in ischemic myocardium.