体外与肝细胞共培养对结肠癌细胞移行和增殖的影响

目的探讨肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖能力的影响。方法在体外建立结肠癌细胞与肝细胞三维共培养模型，将结肠癌细胞系Colon-26细胞培养在共培养系统上层，肝细胞培养在下层。实验分为3组：（1）Colon-26细胞与小鼠的肝细胞共培养（肝细胞组）。（2）与成纤维细胞共培养（纤维细胞组）。（3）Colon-26细胞单独培养（对照组）。观察肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖的影响，以及共培养液内表皮细胞生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）浓度的变化。结果肝细胞组的Colon-26细胞移行能力分别比纤维细胞组和对照组增强（t1=6．296，P=0．000；t2=5．322，P=0．000），Colon-26细胞增殖能力在肝细胞组亦分别比另两组增强（t1=3．905，P=0．005；t2=3．719，P=0．006）。肝细胞组的共培养液中EGF浓度明显升高（z=3．077，P=0．002）。结论在体外能建立结肠癌细胞与肝细胞的三维共培养模型。体外肝细胞能通过分泌生长因子促进结肠癌细胞的移行和增殖。     

移植肝细胞在倒千里光碱处理大鼠肝脏中增殖状态的研究

目的探讨移植肝细胞在倒千里光碱（RS）处理的大鼠肝脏中的增殖情况。方法将5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记的肝细胞通过门静脉途径移植至RS或肝切除处理的大鼠肝脏中，通过免疫组织化学方法检测移植肝细胞数量及流式细胞仪检测S期细胞比率，从而了解供肝细胞在受体内的增殖。结果在接受RS和肝切除处理的大鼠肝脏中，移植的肝细胞数术后3、7、14、28d分别是41±4、67±4、154±10、248±23／1000个细胞，S期细胞比率分别是（4．37±0．21）％、（5．33±0．32）％、（9．55±0．72）％、（17．65±1．76）％，呈上升趋势。结论RS能够为移植肝细胞在受体内的增殖制造足够的增殖空间，在肝损伤造成的肝再生环境中，移植肝细胞的增殖更加显著。     

肝细胞刺激生长因子及三种中药低温保存肝细胞的研究

加入血清较单用ＨａｍＦ１２低温保存肝细胞效果好。若再加入一定量的复方丹参、或清开灵或养气补血方剂提取液（Ｓ液），可使４℃５天冷贮存肝细胞的活细胞率达９０％以上，胞内ＡＬＴ外漏减少，并明显促进再培养肝细胞的增殖。此外，Ｓ液尚可明显提高再培养肝细胞的附壁率。以上药物的保护作用可能与减少脂质过氧化的产生有关。ＨＳＳ对肝细胞也有一定的冷缺血保护作用。     

外源hTERT基因对原代培养肝细胞增殖作用的研究

目的探讨表达hTERT蛋白的重组腺病毒rAd-hTERT感染体外原代培养的肝细胞后对其增殖情况的影响。方法将表达hTERT蛋白的重组腺病毒rAd-hTERT感染体外原代培养的肝细胞。同时设空载体对照组及空白对照组。通过定量PCR及Western-blot检测基因在细胞中的表达情况；MTT法观察其对细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测rAd-hTERT对细胞周期和凋亡的影响。结果（1）以50MOIrAd-hTERT感染肝细胞可明显促进其生长增殖，但不会引起细胞毒性作用。（2）定量PCR在转录水平检测rAd-hTERT感染后的细胞中hTERT表达量明显增加。（3）Western-blot在蛋白水平验证rAd-hTERT感染后的细胞中hTERT蛋白的表达及其蛋白活性。（4）流式细胞DNA含量分析显示，rAdhTERT可引起肝细胞周期S＋62／M期增加，并抑制细胞的凋亡。结论rAd-hTERT在体外能有效促进原代肝细胞的生长。与阴性对照比较，同期生长的肝细胞S＋62／M期细胞增加，凋亡细胞减少（P〈0．05），并未引起细胞的不典型增生表现。     

PLA O CMC纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后凋亡相关蛋白的变化

目的:探讨聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖（PLA O CMC）纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后移植肝细胞凋亡相关蛋白Bcl 2，Bax和Fas表达的变化。方法:原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞。D 氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型。随机分为2组，48 h后分别将5 mLⅠ型胶原凝胶包埋的PLA O CMC纳米粒子黏附培养24 h的猪肝细胞（A组），5 mLⅠ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞（B组）移植至急性肝衰竭大鼠腹腔内。移植量均为5.0×107个肝细胞。采用免疫组化法检测移植后3 d内移植肝细胞Bcl 2，Bax和Fas的表达情况。结果:移植后1，2，3 d，A组Bcl 2阳性细胞百分数明显高于B组（P＜0.05），Bax和Fas阳性细胞百分数明显低于B组（P＜0.05）。结论:PLA O CMC纳米粒子能上调移植猪肝细胞的抗凋亡蛋白的水平和下调凋亡蛋白的水平，具有良好的抗凋亡作用。     

增殖细胞核抗原在肝硬化,肝细胞不典型增生和肝细胞癌中？…

目的 探讨肝细胞癌（ＨＣＣ）的分析状态与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达的关系。方法 采用ＰＡＰ酶标法半定量检测（ＰＣＮＡ）在１９例肝硬变、２１例肝细胞不典型增生（ＬＣＤ）和５４例ＨＣＣ中的标记指数（ＬＩ）。结果 ＰＣＮＡ主要定位于肝癌细胞中。在ＨＣＣⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级中ＰＣＮＡ的标记指数（ＬＩ）分别为２０．６％、４２．２％、６８．９％，均存在着显著性差异（Ｐ〈０．０１）；在肝硬变、ＬＣＤ中的ＬＩ分别     

IL-1β通过诱导一氧化氮的产生抑制肝细胞能量代谢

目的 利用原代培养大鼠肝细胞，研究白细胞介素－1β（IL－1β）对细胞能量同的影响及其作用机制。方法 所有实验使用雄性Wistar大鼠（5－7周龄，体重170－230g），无菌条件下原位胶原酶灌注肝脏分离肝细胞。观察指标饭知：细胞内ATP含量；培养液中酮体比（KBR）；培养液中一氧化氮（NO）浓度；Western Blot方法分析一氧化氮合酶（iNOS）的表达。结果 IL－1β剂量领带地抑制原代培养大鼠肝细胞内ATP含量和KBR；IL－1β剂量和依赖地诱导iNOS的表达和NO的产生；L－Arginine(NO合成底物）显著促进了IL－1β刺激的NO产生，进一步抑制了细胞的能量代谢；L－NMMA（iNOS抑制剂）完全抑制了IL－1β刺激的NO产生，逆转了IL－1β对细胞能量代谢的抑制作用。结论 IL－1β具有抑制原代培养大鼠肝细胞能量代谢的作用，IL－1β的这种作用是通过诱导肝细胞iNOS的表达和NO的产生实现的。     

肝再生刺激因子、表皮生长因子对肝细胞的作用

目的：观察肝再生刺激因子(HSS）及表皮生长因子（EGF)对肝细胞增殖再生作用合适剂量及其联合效应，并推测HSS作用时相。方法：以~3HTdR掺入法检测细胞DNA增殖；体外原代大鼠肝细胞培养不同时间加入HSS,MTT法检测细胞生长状况。结果与结论：1.HSS（≤100μg／ml)和EGF（≤100ng／ml）对肝衍生细胞均有显著刺激作用（P＜0.01）,并存在剂量关系，但剂量过大，刺激作用反而下降。2.HSS、EGF存在协同作用，原代肝细胞、肝癌细胞株（SMMC-7721、BEL-7402）体外培养48h后，经(~3H）TdR掺入法检测cpm值分别为各自对照组的5.94、2.98和3.36倍。3.体外培养原代大鼠肝细胞，于贴壁后Oh.20h加入HSS其刺激作用较40h组显著.提示HSS可能主要作用于肝细胞再生G1/S期。     

细胞凋亡及增殖细胞核抗原双染色在肝细胞肝癌组织中的研究

目的 研究肝细胞肝癌细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）／凋亡细胞比值与肝细胞肝癌分化程度的关系。方法 应用原位末端标记法（TUNEL）及免疫组化双染色技术,对35例肝细胞肝癌石蜡包埋组织进行检测。结果 不同分化程度癌组织中细胞凋亡和PCNA的阳性率不同。分化程度高,细胞凋亡阳性率高、PCNA阳性率偏低;分化程度低,细胞凋亡阳性率偏低、PCNA阳性率高。随分化程度的降低,PCNA／凋亡细胞的比值显著增加,二者有良好的相关性。结论 PCNA／凋亡细胞的比值可作为评估肝细胞肝癌分化程度的指标。     

碱性成纤维细胞生长因子基因敲除肝细胞与结肠癌细胞的关系

我们通过建立一个全新的三维细胞共培养模型观察肿瘤细胞与宿主细胞之间的关系。同时观察来源于野生型及碱性成纤维细胞生长因子（FGF）-2基因敲除的小鼠的肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖的影响，以及共孵育一段时间后培养液内表皮细胞生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）浓度的变化。     

肝癌融合细胞疫苗的快速制备

目的 用48h快速培养获得的成熟树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3构建融合细胞疫苗。方法 用CD14正选磁珠从外周血中分离出CD14^＋细胞，加入含有GM—CSF和IL-4的树突细胞完全培养基培养24h，再加入肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6和PGE2，继续培养24h获得树突细胞并检测免疫分子CD80、CD86、CD83和HLA-DR的表达。用50％聚乙二醇＋10％二甲基亚砜融合HCCLM3与所获树突细胞构建融合细胞并检测其免疫分子的表达。自体T细胞增殖实验按照刺激细胞不同分为融合细胞组（RH）、树突细胞组（DC）、HCCLM3组（H）及树突细胞与HC—CLM3混合组（HH）。结果 48h培养获得成熟树突细胞的CD80、CD86、CD83和HLA—DR表达率可达94．43％、99．71％、62．78％和99．34％，它与HCCLM3构建的融合细胞同样表达此类免疫分子，并且对自体T细胞增殖的刺激作用更强（P〈0．05）。结论 用48h快速培养获得的树突细胞可以成功构建能有效刺激自体T细胞增殖反应的融合细胞，该方法优点显著。     

一种改良的单肝细胞分离方法

目的探讨改良、简化肝细胞的灌注、分离方法，以提高细胞产量，降低制作成本。方法分离、结扎肝上下腔静脉，游离肝下下腔静脉，乙二醇双四乙酸(EGTA)门静脉原位灌注，剪开肝下下腔静脉，离体；1640液内剪碎、0．05％Ⅳ型胶原酶37℃水浴恒温消化、纯化后37℃5％CO2培养箱内孵育培养，观察产量和细胞功能。结果改良的分离方法所获得的肝细胞占细胞总数的95％以上，肝细胞的获取量及纯度同传统方法相比，简化了二步灌注的步骤和所需仪器，极大减少了胶原酶的使用量。结论改良的分离、培养方法经济、高效，可完全保证肝细胞的产量和纯度。     

细胞粘附分子在肝细胞癌发生及转移中的作用

目的 探讨细胞粘附分子在肝细胞癌发生和转移中的作用。方法 运用cDNA基因芯片和逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术检测25例肝细胞癌和8例正常肝组织标本中神经细胞粘附分子（NCAM）、细胞内粘附分子（ICAM）、血管细胞粘附分子（VCAM）的表达。结果 基因芯片检测结果提示细胞粘附分子基因在肝细胞癌中表达均显著增高（P＜0.05)，肝癌转移组与无转移组相差也较明显（P＜0.05)，RT－PCR检测结果与基因芯片结果相同。结论 基因芯片能够为肝细胞癌的相关基因分析提供特异和可靠的数据。肝细胞癌的发生和转移可能与肝脏组织中粘附分子基因表达升高有关。     

分离肝细胞纯化培养方法的比较研究

目的 评价一种可提高肝细胞纯度和存活率的分离培养方法。方法 以体外两步胶原酶灌流法分离肝细胞,然后将其分成两组,对照组在接种培养前不经进一步处理,试验组则在应用适宜的Percoll梯度液离心纯化之后再行培养。藉台盼蓝拒染法比较两组肝细胞的存活率,采用MTT法动态比较两组肝细胞的增殖状态,在相差显微镜下观察细胞的纯度和形态。结果 未经进一步纯化处理的猪肝细胞存活率为90％±5％,鼠肝细胞存活率为80％±5％,两者纯度均约90％;经Percoll梯度液离心纯化后,其高活力肝细胞比率均提高至98％±2％,纯度可达99％以上。从开始接种到大部分肝细胞贴壁生长,试验组比对照组肝细胞的时间有所缩短。结论 用Percoll梯度液纯化新分离肝细胞,可提高肝实质细胞的活力与纯度。     

鹅脱氧胆酸损害肝细胞机制初探

目的 利用原代培养肝细胞,研究鹅脱氧胆酸损害肝细胞机制。方法 ＳＤ大鼠肝细胞原代短期培养,分别加入不同浓度的甘氨鹅氧胆酸（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ,ＧＣＤＣ）后,流式细胞术检测凋亡细胞和坏死肝细胞的比例;抽提ＤＮＡ电泳,涂片后生物素－ｄＵＴＰ标记凋亡细胞。胆总管结扎ＳＤ大鼠肝组织免疫组织化学染色检测Ｂｃｌ－２基因表达。肝细胞与１００μｍｏｌ／Ｌ ＧＣＤＣ和不同浓度的果糖培养后,     

体外肝细胞极性的重建

目的 使培养肝细胞在体外重建细胞极性。方法 利用三明治构型培养成鼠肝细胞并观察其形态、特异性膜区域蛋白分布并以单层胶原培养肝细胞作对照。结果 三明治构型肝细胞呈单层生长，形成肝板样结构，伴胆小管网络形成，免疫组织化学证明肝细胞膜区域蛋白呈特异性分布。而在对照组，肝细胞基本没有形成肝板样结构，肝细胞膜区域蛋白没有形成特异性分布。结论 三明治构型培养肝细胞在体外重建细胞极性，保留了体内肝细胞的特点。     

自体脾内移植的肝细胞凋亡及与其功能的关系

目的探讨肝细胞脾内移植后发生非免疫排斥性细胞凋亡及其对总体功能发挥的影响。方法应用TUNEL法原位观察80例大鼠肝细胞脾内移植后移植肝细胞的凋亡;分析移植肝细胞凋亡指数与肝化脾ALT含量及同位素99mTC-HIDA摄取量的相关性。结果应用了肝细胞生长因子的大鼠肝细胞脾内移植后移植肝细胞的凋亡指数为（2．76±1．08）,而未应用者则为（5．26±2．14）,两者差异有显著性（P＜0.01）。两组中移植肝细胞凋亡指数与肝化脾ALT含量和99mTc-HIDA摄取量均呈负相关。结论肝细胞脾内移植后较易发生非免疫排斥性细胞凋亡,其凋亡指数与肝细胞生存量及总体功能呈负相关,肝细胞生长因子可抑制移植肝细胞凋亡,从而提高其长期存活量。     

肝星状细胞对大鼠肝部分切除术后肝再生修复的影响

目的 探讨肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在大鼠肝部分切除术后对肝损伤修复的影响.方法 体外实验部分：将大鼠肝星状细胞（HSCs）与大鼠肝细胞系（BRL-3A）共培养,CCK-8比色法检测细胞增殖情况;ELISA法检测培养肝星状细胞上清液中细胞因子,即肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor,IGF）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、转化生长因子-α（transfactor growth factor-α,TGF-α）含量.体内实验部分;将45只260 ～330 g健康雄性SD大鼠随机分为三组：正常组（生理盐水组）、对照组（肝星状细胞培养液组）、实验组（肝星状细胞培养上清液组）.各组分别于肝大部切除术后第3、7、12天取血清检测肝功能情况并计算肝再生指数;HE染色切片显微镜下观察肝脏病理结构改变情况;免疫组织化学染色法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen,PCNA）、平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、甲胎蛋白（a1pha feta1 protein,AFP）及白蛋白（albumin,ALB）的表达情况.结果 ①CCK-8法检测肝星状细胞能促进肝细胞增殖（P＜0.05）;②上清液较培养液中细胞因子HGF、TGF-α含量多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;③实验组肝再生指数比对照组大,差别具有统计学意义（P＜0.05）;④实验组大鼠AST随着时间的推移,较对照组下降明显,差别有统计学意义（P＜0.05）;⑤实验组PCNA表达量较正常组、对照组增多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;⑥平滑肌肌动蛋白、白蛋白、甲胎蛋白三组间差别不显著（P＞ 0.05）.结论 ①体外肝星状细胞能促进肝细胞增殖;②肝星状细胞培养上清液能促进大鼠肝部分切除术后肝再生,其分泌的多种细胞因子在肝损伤再生修复中起了重要作用.     

小鼠成体肝脏干细胞体外培养模型的建立

目的 观察正常成体小鼠肝细胞的增殖能力和分化潜能,分离成体小鼠肝脏内可能存在的干细胞或祖细胞,建立细胞培养模型.方法 应用改良的Seglen二步法灌注和离心分离肝脏细胞,用含血清的改良DMEM培养基进行培养,持续观察超过60 d.应用免疫荧光技术对肝细胞及其形成的克隆进行Albumin、AFP和CKl9染色.结果 部分肝脏细胞培养第2～3天后活化,迅速增殖并形成细胞克隆,培养30 d后克隆内出现类似成熟的肝细胞,细胞克隆持续扩增超过60d.该类细胞培养第1天强阳性表达肝细胞标记物Albumin,培养第5天细胞克隆开始表达肝脏干细胞标记物AFP,第55天表达胆管细胞标记物CKl9.结论 在成体小鼠未损伤肝脏内存在一种成体肝脏祖细胞(adult hepatic progenitor cells,AHPCs),该细胞体外培养具有较强的增殖能力,可分化为肝细胞和胆管细胞,并成功建立了AHPCs的体外培养模型.     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。