白藜芦醇抗肝星状细胞活性和抗肝纤维化的实验研究

目的 探讨白藜芦醇调节肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活性及其抗肝纤维化作用.方法 从大鼠肝脏分离纯化培养HSCs;DCFH-DA法检测不同浓度白藜芦醇对HSCs中活性氧的影响;通过CCK-8比色法检测白藜芦醇对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCs的α-肌动蛋白(α-SMA)表达.通过PCR检测白藜芦醇对HSCs活性相关基因表达的影响.给大鼠肝纤维化模型经腹输注白藜芦醇,检测肝组织病理切片,肝纤维化指标.结果 从大鼠活体分离培养HSCs.白藜芦醇可抑制HSCs中活性氧的产生;明显抑制HSCs的α-SMA表达(103 ±7,90 ±7,63 ±4,53 ±3,F=62.179,P ＜0.05)与增殖(0.536±0.052,0.411±0.047,0.327±0.063,0.312±0.032,F=12.776,P＜0.05);抑制HSCs活性相关基因(大鼠生肌调节因子、胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅰ)的表达(122 ±.5,96±3,68 ±3,60 ±3,F=180.600,P ＜0.05) (100 ±8,82±3,53±3,51 ±2,F =77.451,P＜0.05) (170±3,147±4,92 ±3,90 ±2,F=462.878,P＜0.05).大鼠活体实验显示白藜芦醇可降低肝羟脯氨酸含量及血清胶原蛋白Ⅲ和透明质酸水平(358.3 ±20.2,320.5±15.3,290.3±24.5,F=23.929,P ＜0.05) (32.8±3.1,28.9±1.3,25.3±1.8,F=20.050,P＜0.05)(276.3±17.8,225.3±28.3,195.4±11.2,F=18.585,P＜0.05).结论 白藜芦醇能够抑制大鼠HSCs的活化增殖,对活体肝纤维化具有一定的抑制作用,这可能与白藜芦醇的抗氧化及抑制MyoD的表达作用有关.     

脂肪特异性蛋白27对大鼠肝星状细胞活化的影响

 目的：探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）对肝星状细胞（HSCs）增殖和活化的影响及其对纤维化相关蛋白的调节作用。方法：从SD大鼠肝脏提取HSCs并培养,采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色和Western blotting检测原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表达。构建携带Fsp27基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h,通过CCK-8比色法检测Fsp27对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,了解HSCs的活化状态;实时荧光定量PCR检测Fsp27对HSCs中纤维化相关蛋白［包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）和转化生长因子β1（TGF-β1）］ mRNA表达的影响。结果：成功分离大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表达差异显著（P<0.01）;活化HSCs成功转染携带Fsp27基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖被明显抑制（P<0.05）;Fsp27促进MMP-2 mRNA的表达（P<0.05）,降低TIMP-1和TGF-β1 mRNA的表达（P<0.05）。结论：Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化,并调节纤维化相关蛋白的表达。Fsp27的作用可能与其维持HSCs静息状态细胞表型有关。     

脂肪特异性蛋白27（Fsp27）基因延缓四氯化碳所致实验大鼠肝纤维化

目的 探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）基因对活体肝纤维化进程的调节作用.方法 分离原代肝星状细胞（HSCs）,采用PCR技术检测在原代HSCs及活化HSCs中的Fsp27基因表达；构建携带Fsp27目的基因的慢病毒；建立肝纤维化模型；慢病毒转染模型鼠肝脏,对实验大鼠行肝脏病理切片检查,采用ELISA法和放射免疫法分别检测肝脏及血浆纤维蛋白含量.结果 Fsp27基因在原代HSCs及活化HSCs中表达差异有统计学意义（P＜0.01）；成功构建了Fsp27基因的慢病毒载体；成功建立了肝纤维化活体模型；Fsp27基因慢病毒成功转染大鼠肝脏,Fsp27基因减轻了肝脏的纤维化程度.结论 Fsp27基因具有延缓活体肝纤维化进程的作用.     

脂肪间质干细胞对肝星状细胞活化、增殖、凋亡相关作用的研究

目的探讨脂肪间质干细胞(ADSCs)对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化凋亡的影响及其探讨产生作用的原因。方法从肝脏及腹腔脂肪分别分离纯化培养HSCs及ADSCs,通过半透膜(transwell insert)在6孔塑料培养板上建立HSCs与ADSCs的双层培养体系,大鼠正常肝细胞系(BRLs)及HSCs培养分别作为对照。通过CCK-8比色法检测ADSCs对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解HSCs的活化状态;流式细胞仪检测ADSCs对HSCs凋亡的影响。最后通过检测培养液中细胞因子的含量探讨可能的作用机制。结果 HSCs与ADSCs共培养72h,ADSCs明显抑制HSCs的活化与增殖,促进HSCs的凋亡,培养液细胞因子检测显示ADSCs比BRLs分泌更多的HGF,而较少分泌TGF。结论 ADSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能。ADSCs的治疗作用可能与其分泌的细胞因子有关。     

脂肪间质干细胞抑制肝星状细胞增殖活化及肝脏纤维化

目的 探讨脂肪间质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化的影响及其对活体肝硬化模型的治疗作用.方法 分别分离纯化培养HSCs及ADSCs,通过半透膜(transwell insert)建立HSCs与ADSCs的双层培养体系,大鼠正常肝细胞系((buffalo rat liver cells,BRLs)培养作为对照.通过CCK-8比色法检测ADSCs对HSCs增殖的影响;Western blot检测HSCs的α-肌动蛋白(α-SMA)表达;建立鼠肝硬化模型,经门静脉输注ADSCs或BRLs,检测肝组织肝硬化;通过检测培养液中细胞因子的含量探讨可能的作用机制.结果 成功分离获得原代HSCs与ADSCs,活化的HSCs与ADSCs共培养72 h,与对照组相比,ADSCs明显抑制HSCs的活化(各组灰度值分别为1.4±0.2,152±14,258±18,F=283.348,P＜0.05)与增殖(各组吸光度A值分别为2.172±0.107,1.424±0.013,1.209±0.117,F=90.605,P ＜0.05),活体移植显示ADSCs对肝硬化具有明显抑制作用(分别F=77.234、65.164、58.309,均P ＜0.05).培养液细胞因子检测显示ADSCs比BRLs分泌更多的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)(F=0.005,P＜0.05),分泌较少的转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β1)(F=1.767,P＜0.01)及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)(F=2.301,P＜0.05). 结论 ADSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs活化增殖的潜能,对活体肝硬化进程具有一定的抑制作用.     

肝细胞、肝窦内皮细胞分离培养及肝细胞支架的制备

目的：探究大鼠肝细胞、肝窦内皮细胞的分离培养方法及肝去细胞支架的制备方法。方法：用胶原酶IV消化肝脏组织后经洗涤、过滤、离心等步骤分离出大鼠肝细胞,然后置于培养基内进行纯化、培养后行细胞免疫组织化学检测;通过Percoll密度梯度离心法分离出肝窦内皮细胞置于培养基内纯化、培养后行免疫荧光检测;肝组织经循环灌注去细胞处理制备成大鼠肝细胞去细胞支架后经扫描电镜证实。结果：分离出的大鼠肝细胞在显微镜下呈光亮圆形,饱满,胞核清晰。肝细胞细胞角蛋白18免疫组织化学染色后见胞浆内存在棕黄色颗粒。肝窦内皮细胞呈梭形,细胞核位于中央。内皮素-1免疫荧光染色后细胞表面呈红色信号。制备成的大鼠肝脏去细胞支架在扫描电镜下显示细胞外基质保留,无细胞核及细胞质成分。结论：成功分离出了肝细胞和肝窦内皮细胞并成功制备了肝去细胞支架。     

脂肪特异性蛋白27基因抑制大鼠肝星状细胞增殖活化

目的 探讨脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化的影响及其对纤维化相关基因的调节作用.方法 提取HSCs并培养.用实时定量PCR技术检测原代HSCs及活化HSCs中的Fsp27基因表达.构建携带Fsp27目的基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h.通过CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解HSCs的活化状态.实时定量PCR技术研究Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 成功分离原代HSCs,Fsp27基因在原代HSCs及活化HSCs中表达差异显著(P＜0.01).活化HSCs成功转染携带Fsp27目的基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖受到明显抑制(P＜0.05);Fsp27基因促进MMP-2的表达(P＜0.05),降低了TIMP-1及TGF-β1的表达(P＜0.05).结论 Fsp27基因具有抑制HSCs活化增殖的潜能,Fsp27基因可调节纤维化相关基因的表达.Fsp27基因的作用可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关.     

胆红素浓度对肝星状细胞活化增殖和凋亡的影响

目的 探讨低浓度胆红素( bilirubin)对活化态肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖、活化、凋亡的影响.方法 从肝脏分离纯化培养HSCs,DCFH-DA法检测不同浓度胆红素对HSCs中活性氧的影响.通过CCK-8比色法检测胆红素对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(d-SMA)的表达.流式细胞仪检测胆红素对HSCs凋亡的影响.PCR检测胆红素对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 分离并培养HSCs,低浓度胆红素浓度(0、1、10、20 mg/L)抑制HSCs中活性氧的产生,明显抑制HSCs的增殖(0.624±0.092,0.536±0.127,0.407±0.033,0.399±0.022,F=13.454,P＜0.05)及α-SMA的表达(339 ±2,336±10,246±7,242±5,3.7±0.3,F=191.107,P＜0.05),促进HSCs的凋亡(2.69±0.07％,2.95±0.10％,4.41±0.22％,4.91±0.86％,F=34.731,P＜0.05),改变HSCs纤维化相关基因的表达,TIMP-1 mRNA/MMP-2 mRNA的比值呈降低趋势(54±2,65±2,47 ±2,44±2,F=73.400,P＜0.05).结论 低浓度胆红素具有抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能.胆红素的作用可能与其抗氧化功能有关.