全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的 建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2( AnxA2)的大鼠—小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系.方法 利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠—小鼠融合单抗杂交瘤细胞株.采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性.结果 通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠—小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白.结论 该研究所获得的大鼠—小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障.     

抗人滋养层细胞表面抗原-2单抗的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性?方法:以胰腺癌细胞系BxPC3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合后制备单抗?通过酶联免疫法?免疫荧光?免疫沉淀和质谱分析?流式细胞术?免疫组织化学等方法,鉴定单抗的免疫学特性?结果:通过细胞的融合与筛选,获得了持续分泌抗Trop2单抗的杂交瘤细胞株,该抗体可以识别细胞表面的Trop2膜蛋白,也可用于免疫组化识别人肿瘤组织中的Trop2蛋白,同时该抗体对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用?结论:该单抗具有作为Trop2阳性表达肿瘤靶向治疗的潜在应用价值?     

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2（AnxA2）的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。方法利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠-小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白。结论该研究所获得的大鼠-小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障。     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

LAMP2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗-lamp2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法:根据已发表的文献通过人工合成多肽,并将此多肽分别连接KLH和BSA,以peptide-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠,取血清效价大于 1:10000 的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 进行融合,以peptide-BSA包被,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂交瘤细胞的上清进行筛选;得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,采用免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别目的蛋白.结果:得到一株能稳定分泌抗-LAMP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,应用免疫组化方法证明新制备的抗-LAMP2单克隆抗体能识别天然的 LAMP2;此单克隆抗体的亚类为.结论:杂交瘤细胞株能稳定分泌目的单克隆抗体;免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别自己天然的目的蛋白,为更好地研究LAMP2的生物学功能奠定了基础.     

抗蛋白S单克隆抗体的制备

目的 制备抗蛋白S(protein S)单克隆抗体.方法 用微量蛋白S抗原对Balb/c小鼠脾内包埋免疫,取小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合后对杂交瘤细胞进行筛选克隆化培养,建立了10株稳定分泌抗蛋白s单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结景对其中的一株2E3进行研究,其分泌的抗体为IgG1亚类.腹水效价1:106阳性,采用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水,Western blot测定显示单克隆抗体2E3可特异性地识别分子量为69,000的抗原分子.此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上,ELISA检测抗体滴度无明显降低.结论脾内包埋法成功制备抗蛋白S单克隆抗体,使蛋白S的临床深入研究和应用成为可能.     

鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,探讨X4蛋白的结构和功能,以及临床应用的价值.方法:以重组SARS病毒X4蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合, 通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫荧光实验等方法鉴定其特性.结果:成功地建立了3株稳定分泌抗X4蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A5,8H6和4A2.3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG2a.通过ELISA, Western blot等方法的鉴定,抗X4蛋白的单克隆抗体能与X4蛋白发生特异性反应.免疫荧光实验的结果表明,X4蛋白的单克隆抗体能与SARS-病毒感染的Vero E6 细胞发生特异性结合.结论:获得了特异性识别SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,为SARS病毒X4蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

鼠抗沙眼衣原体Tarp蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗衣原体Tarp蛋白的单克隆抗体,为探讨Tarp蛋白的生物学特性及功能提供实验工具.方法 克隆表达沙眼衣原体血清型D重组Tarp融合蛋白,并以其为免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,应用间接免疫荧光法筛选阳性克隆和有限稀释克隆化,获得鼠抗沙眼衣原体血清型Dtarp蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA法鉴定单克隆抗体的抗Tarp特异性.并应用问接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的亚类和衣原体种属特异性.结果 成功克隆表达了重组GST-Tarp融合蛋白,其相对分子质量约为136 000;成功地建立了7株稳定分泌抗Tarp蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株;7株单克隆抗体均特异性的识别Tarp蛋白而不识别其他衣原体性蛋白;2株单克隆抗体(R586.2和R8G7.2)的免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余5株单克隆抗体(R4D5,R2HI.2,R12812,R2H7和RSG8.1)的免疫球蛋白亚类均为IgG1;7株单克隆抗体全部特异性识别衣原体血清型A、D、L2,而不识别MoPn、6BC和AR39.结论 获得了特异性识别沙眼衣原体血清型Dtarp蛋白的单克隆抗体,为Tarp蛋白的结构及生物学功能研究莫定了基础.     

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的 制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力.结果 筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带.杂交瘤细胞培养上清效价为1:640,腹水效价为1:25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106 L/mol.结论 成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础.     

Detection and analysis of anti-latent membrane protein 2A antibodies in the sera of patients with Epstein-Barr virus associated malignancies

Background Epstein-Barr virus (EBV) associated malignancies with a Type Ⅱ latency gene expression pattern, such as Hodgkin‘s disease, and nasopharyngeal carcinoma (NPC) , frequently express the EBV antigen latent membrane protein 2A (LMP2A). We expected to establish a highly expressing LMP2A yeast cell strain and get the high quality LMP2A protein, which was used for detection, analysis and characterization of its antibodies in various patients‘ sera of EBV associated malignancies. Methods The plasmid pPICZαA-LMP2A containing the full length of LMP2A cDNA was constructed and transformed to Pichia pastoris GS115 to express LMP2A protein. After fermentation and purification, the LMP2A protein was used as an antigen to detect anti-LMP2A antibodies (Abs) in the sera of patients with EBVassociated malignancies in enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or Western-blot. Results LMP2A was expressed successfully with an expected molecular weight of approximately 54 kD and Abs to LMP2A were strikingly specific to NPC. Two-thirds or more sera from NPC patients were positive for antiLMP2A immunoglobulin G (IgG) Abs. The antibodies were absent from the sera of other EBV-associated diseases except a small fraction of the gastric carcinoma. Comparing anti-viral capsid Ags (VCA) IgA and LMP2A IgA titers in the sera from 76 NPC patients, only 55% were positive for anti-LMP2A IgA Abs while 70% were positive for anti-VCA IgA. However, we found that 3 sera negative for VCA IgA were positive for LMP2A IgA. Conclusion The results suggested the potential significance of LMP2A specific Abs for the diagnosis of EBVassociated malignancies, especially NPC.     

PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定

目的 通过谷胱甘肽转硫酶偶联的血小板衍生因子受体氮端的融合蛋白(GST-PDGFR-N)制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-PDGFR-N融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗PDGFR的单克隆抗体,用间接ELISA、Western blot、免疫组化等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得两株能稳定分泌抗PDGFR单克隆抗体的细胞3B12F5和3C6H7C11,亚类鉴定两种单抗均为IgG1.间接ELISA法测定两株细胞腹水抗体的效价分别为1:102400为和1:25600.Western blot法显示PDGFR单克隆抗体特异性地识别免疫原和胶质瘤细胞株U251中的抗原成分.细胞免疫组化显示此单抗可以特异的识别胶质瘤细胞株U251和膀胱癌细胞株BIU87中表达的PDGFR抗原.结论 成功制备PDGFR单克隆抗体,为研究PDGFR的表达情况和临床检测提供了一个有用的工具.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的 制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法 以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株，诱发小鼠产生单抗腹水，用(NH4)2SO4盐析纯化腹水，用间接ELISA法测定单抗效价，用Westemblotting测定抗体特异性。结果 建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株，其中286杂交瘤细胞株抗体效价最高，其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价，分别为l：50000和l：10000。用Westem blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量3l000左右位置出现明显的一条染色条带。结论 自行制备的抗人SP-A单抗，其具有特异性强、效价高的特点。     

抗蛋白酶激活受体?鄄2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备出一种具有多种用途的抗蛋白酶激活受体-2(PAR-2)单克隆抗体(mAb).方法:用人工合成的11肽PAR-2作为免疫原,采用皮下多点注射方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接ELISA法筛选.通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性.结果:获得1株可稳定分泌抗:PAR-2 mAb的杂交瘤细胞.其分泌的mAb为IgM型,ELJSA法检测杂交瘤细胞培养上清效价为1:16;点杂交分析表明此抗体可特异性结合PAR-2;免疫组化染色显示该单克隆抗体与人肺组织中的肺泡上皮细胞和平滑肌细胞,结肠组织中的腺上皮细胞和疑似淋巴细胞,扁桃体中的淋巴细胞,包皮组织中的鳞状上皮细胞呈阳性反应;流式细胞仪分析显示与人肺腺癌细胞系A549细胞中的PAR-2呈阳性反应;激光共聚焦扫描显微镜观察发现荧光标记的阳性反应物位于A549细胞的胞膜和胞浆.结论:成功地制备出可用于免疫组化和点杂交的抗PAR-2单克隆抗体,为PAR-2相关性疾病的研究提供了有用的工具.     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.     

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析

目的：研制抗人血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件.方法：以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定.结果：得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色.结论：成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件.     

阻断型鼠抗人FL单克隆抗体的制备

目的研制鼠抗人Flt3-ligand（FL）单克隆抗体（mAb）及其生物学特性研究。方法采用高表达膜FL的基因工程细胞株L929／FL细胞免疫BALB／c小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,免疫荧光标记和流式细胞术筛选阳性株,采用快速定性试纸法鉴定单抗亚类、间接免疫荧光法检测单抗对肿瘤细胞株的识别谱。然后研究所获得的抗人FL单抗＆FL蛋白对THP-1细胞生长的影响。结果得到稳定分泌鼠抗人FL单克隆抗体的杂交瘤细胞一株,并将其分泌的单克隆抗体命名为3E5。经快速定性试纸法鉴定3E5重链为IgGl,轻链为K链。3E5可有效识别不同肿瘤细胞株表达的FL。FL蛋白能促进THP-1细胞的增殖,加入3E5单克隆抗体后能够抑制这种促进作用。结论获得-阻断型单克隆抗体3E5,为研究FL及Flt3功能提供了实用的基础。