洛铂对结肠癌细胞的抗肿瘤活性及机制研究

目的探索洛铂在结肠癌细胞中的抗肿瘤活性,阐明潜在分子机制,为临床应用提供理论证据。方法体外培养结肠癌细胞SW480,用MTT比色法和克隆形成实验检测不同浓度的洛铂分别处理结肠癌SW480细胞株24、48 h和72 h后,对结肠癌细胞增殖活性的抑制作用;用流式细胞仪检测不同浓度梯度的洛铂对结肠癌SW480细胞株凋亡率的影响;采用Western blot检测洛铂对SW480细胞凋亡相关蛋白CASPASE-3、BAD、BCL-2的表达;添加AKT抑制剂及激动剂,采用Western blot检测CASPASE3、AKT、p AKT、BAD、p-BAD和BCL-2表达量,探讨洛铂促结肠癌细胞凋亡的作用机制。结果洛铂能显著抑制体外培养的SW480细胞的生长,呈现为时间剂量依赖型;洛铂可诱导结肠癌SW480细胞凋亡,且随着洛铂浓度的增加,结肠癌SW480细胞凋亡率显著提高,结果具有统计学意义。洛铂可下调结肠癌细胞抑凋亡基因BCL-2蛋白表达,上调促凋亡基因BAD和CASPASE-3蛋白表达量;添加AKT抑制剂MK-2206后,pAKT、p-BAD和BCL-2蛋白表达显著降低,CASPASE3蛋白表达显著升高,促进了细胞凋亡,结果具有统计学差异。添加AKT激动剂SC97处理后,pAKT、p-BAD和BCL-2蛋白表达显著上调,CASPASE3蛋白表达显著下调,抑制了细胞凋亡,结果具有统计学意义。结论洛铂能显著抑制人结肠癌SW480细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,洛铂可能通过AKT/BCL-2/BAD信号通路发挥促细胞凋亡作用,是一种有效的抗结肠癌药物。     

LncRNA GAS5通过AKT/mTOR通路对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的探究长链非编码核糖核酸生长组织特异性转录体5(LncRNA GAS5)通过AKT/mTOR通路对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养人结肠癌细胞SW480,随机分为对照组、LncRNA GAS5过表达质粒组、LncRNA GAS5空载质粒组、LncRNA GAS5 siRNA组、LncRNA GAS5 siRNA阴性对照组,分别转染质粒及siRNA后,采用实时荧光定量(q RT-PCR)检测各组细胞LncRNA GAS5表达,采用CKK-8、细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,免疫印迹检测各组细胞凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-1(Bcl-2)、关联BCL-2的蛋白质X(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)]、AKT/mTOR通路蛋白[丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶点(p-mTOR)]表达情况。结果与对照组相比,LncRNA GAS5 siRNA组SW480细胞LncRNA GAS5表达、凋亡率、Bax及caspase-3蛋白表达降低,细胞活力、相对细胞克隆形成、Bcl-2蛋白表达、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR升高,差异均有统计学意义(P0.05);LncRNA GAS5过表达质粒组SW480细胞LncRNA GAS5表达、凋亡率、Bax及caspase-3蛋白表达升高,细胞活力、相对细胞克隆形成、Bcl-2蛋白表达、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低,差异均有统计学意义(P0.05);LncRNA GAS5 siRNA阴性对照组、LncRNA GAS5空载质粒组SW480细胞各指标差异无统计学意义(P0.05)。结论上调LncRNA GAS5可抑制SW480细胞增殖,促进其凋亡,可能是通过抑制AKT/mTOR通路激活实现的。     

miR-200a在结直肠癌细胞系中的表达及其对高转移细胞系Lovo的影响

目的检测结肠癌细胞系中miR-200a对高转移细胞系Lovo的影响。方法采用荧光定量PCR法检测6种结肠癌细胞系
HCT116、HT29, LS174T、SW480、SW620和Lovo中miR-200a的表达水平,在高转移细胞系Lovo中瞬时转染miR-200a mimics
使其高表达miR-200a,检测高表达miR-200a后Lovo细胞增殖、迁移、细胞同质黏附能力和凋亡等情况的变化。结果miR-200a
在6种细胞系中存在差异性表达,其中具有高转移潜能的Lovo中表达最低,成瘤但不转移的细胞系HCT116表达最高。在Lovo
细胞高表达miR-200a后,Lovo细胞的增殖和迁移能力明显减弱、细胞同质黏附能力增强且凋亡增加。结论miR-200a在结肠
癌细胞系中表达失常,其作用可能与结肠癌细胞的侵袭和转移有关,高表达miR-200a 能抑制Lovo细胞增殖和迁移、增强细胞
间黏附能力、促进凋亡,其分子机制有待进一步研究。
     

miR-146a在结肠癌中的表达及意义

目的探讨miR-146a在结肠癌中的表达与功能。方法qRT-PCR分析结肠癌组织、毗邻正常细胞组织以及结肠癌细胞系
miR-146a的表达水平,MTT法测定结肠癌细胞系SW620转染miR-146a模拟物后的增值,FACS法检测细胞周期与凋亡状况。
结果43 份结肠癌组织样品中,36 份呈现miR-146a 表达量下调,并且该下调表达情况与肿瘤增殖情况（P=0.010）相一致,
miR-146a表达量还与患者肿瘤大小、临床分期密切相关,同时miR-146a表达量较高的患者较比表达量低的患者寿命要长（P=
0.011）,MTT检测表明,miR-146a能抑制细胞增殖（P<0.005）,流式细胞仪检测结果表明,转染miR-146a的SW620细胞相比对
照组细胞,凋亡比例上升（11.9%∶5.9%）,但是对细胞周期没有什么影响。结论miR-146a可能是结肠癌新的抗癌靶标,能抑制结
肠癌细胞增殖,在结肠癌中具有重要作用。
     

五味子多糖对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用

目的：探讨五味子多糖（Schisandra polysaccharide,SCP）对人结肠癌SW480细胞的增殖和凋亡的影响及其机制。方法：将人结肠癌SW480细胞分为对照组,SCP高剂量组、SCP中剂量组和SCP低剂量组,MTT法检测肿瘤细胞增殖情况,流式细胞仪检测凋亡,免疫组化法检测凋亡蛋白表达。结果：与对照组比较,SCP高、中、低剂量组均能不同程度抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,使凋亡蛋白Bcl－2表达降低,Bax表达增加,具有剂量依赖关系。结论：五味子多糖能够抑制结肠癌SW480细胞的增殖同时促进细胞凋亡,这可能与其影响凋亡蛋白的表达相关。     

黄连素抑制直肠癌SW480细胞增殖的实验研究

【摘要】目的 观察黄连素抑制直肠癌SW480细胞增殖的效果并探讨其作用机制。方法 治疗组用不同浓度的黄连素（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L）干预SW480细胞株。MTT比色法观察最佳作用浓度及细胞增殖效果。结果显示最佳作用浓度为150μmol/L。后续实验治疗组SW480细胞用150μmol/L黄连素干预48小时, 对照组用RPMI 1640培养基。流式细胞仪检测两组SW480细胞的细胞周期, Annexin V检测细胞凋亡。免疫印迹法（Western blot）分析治疗组和对照组中Livin、YKL 40、AKT和Cyclin D1蛋白的表达。酶联免疫吸附法检测两组促血管生成素 2（Ang 2）的表达水平。结果 黄连素干预SW480细胞后对细胞增殖有明显抑制作用, SW480细胞周期被阻滞在G1期并伴有细胞凋亡比例明显增加。Livin、YKL 40、AKT和Cyclin D1蛋白的表达水平明显降低, 并且黄连素可明显抑制YKL 40/AKT/Cyclin D1信号通路和SW480细胞中Ang 2的表达水平。结论 黄连素能有效抑制SW480细胞的增殖, 其作用机制包括下调YKL 40/AKT/Cyclin D1信号通路从而使细胞周期被阻滞在G1期, 通过降低Livin蛋白的表达诱导细胞凋亡, 并可下调Ang 2的表达抑制血管生成。     

氯硝柳胺对人结肠癌SW480细胞生长及凋亡的影响

目的:研究氯硝柳胺对人结肠癌SW480细胞生长、周期及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:CCK-8法检测氯硝柳胺对SW480细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测氯硝柳胺对SW480细胞周期及凋亡的影响,Western Blot法检测氯硝柳胺对SW480细胞蛋白水平的调控。结果:氯硝柳胺对SW480细胞生长有显著抑制作用,其半抑制浓度为4.6μmol/L。与对照组相比,实验组SW480细胞G0/G1期比例增加,S期细胞比例减少,凋亡率增加(P<0.05)。实验组β-Catenin蛋白的表达较对照组下调(P<0.05),Cyclin D1表达无显著差异(P>0.05)。结论:氯硝柳胺可抑制结肠癌SW480细胞的生长,将其阻滞在G0/G1期,促进细胞凋亡,抑制Wnt/β-Catenin通路,是一个具有潜力的抗结肠癌药物。     

五味子多糖对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨五味子多糖(Schisandra polysaccharide,SCP)对人结肠癌SW480细胞的增殖和凋亡的影响及其机制。方法:将人结肠癌SW480细胞分为对照组,SCP高剂量组、SCP中剂量组和SCP低剂量组,MTT法检测肿瘤细胞增殖情况,流式细胞仪检测凋亡,免疫组化法检测凋亡蛋白表达。结果:与对照组比较,SCP高、中、低剂量组均能不同程度抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,使凋亡蛋白Bcl-2表达降低,Bax表达增加,具有剂量依赖关系。结论:五味子多糖能够抑制结肠癌SW480细胞的增殖同时促进细胞凋亡,这可能与其影响凋亡蛋白的表达相关。     

miR-93在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究分析miR-93在结肠癌组织中的表达,探讨其在结肠癌细胞增殖、细胞周期及凋亡中的意义。方法采用TagMan MGB探针法定量分析101例结肠癌组织及癌旁组织miR-93的表达;利用反义技术降低结肠癌细胞SW480和LoVo的miR-93的表达;采用MTT比色法检测细胞增殖的改变;利用流式细胞技术检测结肠癌细胞周期和凋亡情况。结果在101例结肠癌组织中,53.47%(54/101)的结肠癌组织miR-93表达明显高于癌旁组织(P<0.05);反义miR-93转染结肠癌细胞SW480和LoVo后,miR-93的表达明显降低,细胞生长受到明显抑制,主要停滞在G0/G1期,早期凋亡明显增加。结论 miR-93在结肠癌组织中表达上调。降低其表达能明显抑制SW480和LoVo细胞的生长和诱导细胞早期凋亡。     

光动力作用对人结肠癌细胞转录因子激活蛋白-4表达的影响

目的观察不同浓度光敏剂酞菁锌对结肠癌细胞株SW480的生长抑制作用及其对转录因子激活蛋白-4(AP-4)表达的影响。方法应用CCK-8方法评估光动力作用后SW480细胞的存活率,通过流式细胞技术、RT-PCR技术、Western blot技术检测光敏剂酞菁锌光动力作用后对SW480细胞凋亡和AP-4基因表达等生物学行为的影响。结果酞菁锌光动力治疗对结肠癌细胞株SW480生长增殖具有明显抑制作用,其效应呈浓度和光照剂量依赖性;流式细胞仪分析显示SW480细胞呈G2/M期阻滞;SW480细胞的凋亡率随酞菁锌浓度增加逐步上升。2.0μg/mL酞菁锌光动力作用SW480细胞48 h后其AP-4 mRNA水平下降了81%,培养液上清液AP-4蛋白浓度下降了75.6%(P<0.01)。结论应用光敏剂酞菁锌光动力作用能有效抑制SW-480细胞AP-4的表达,进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡,为结肠癌治疗提供了新的思路和手段。     

MsrA在结直肠癌干细胞中的表达及意义

目的探讨MsrA 在结直肠癌干细胞中的表达及与结直肠癌发生、发展的关系。方法免疫磁珠分选结直肠癌细胞株
SW480细胞中CD133+/CD44+/ESA+亚群细胞,RT-PCR检测癌细胞、癌干细胞和正常大肠粘膜细胞中MsrA的表达以及MsrA过
表达对VEGF、MMP-13和CXCR4表达的影响,MTT检测过表达MsrA对结直肠癌干细胞增殖的影响。结果癌干细胞中MsrA
的表达水平明显高于癌细胞,癌细胞中MsrA的表达水平明显高于正常大肠粘膜细胞。MsrA过表达会抑制结直肠癌干细胞的
增殖以及下调VEGF、MMP-13和CXCR4的表达。结论MsrA可能通过下调VEGF、MMP-13和CXCR4的表达和抑制细胞增
殖来抑制结直肠癌的发生、发展。
     

HMGB1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外增殖的影响

目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1增殖的影响并探讨其可能的机制。方法用siRNA干扰
鼻咽癌细胞株C666-1 HMGB1基因,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测cyclin D1,CDK6及相
关通路蛋白表达。用带GFP的HMGB1质粒转染鼻咽癌细胞株C666-1,EDU和CCK-8检测细胞增殖。结果干扰HMGB1的表
达后,细胞增殖明显减慢（P<0.001）;细胞周期分析显示处于G1期细胞比例增多（P<0.001）,S期细胞比例明显下降（P<0.001）;
Western blot结果显示cyclin D1、CDK6的表达下调,STAT3,P-STAT3的表达也下调。过表达HMGB1后,EDU显示处于S期细
胞比例增多（P<0.05）;CCK-8显示细胞增殖明显增快（P<0.001）。结论HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1的增殖,可能通过
STAT3信号通路上调cyclin D1、CDK6促进鼻咽癌细胞株C666-1由G1期进入S期从而调控其增殖。
     

稳定低表达DNA甲基转移酶3b基因对膀胱癌细胞生长和凋亡的影响

目的探讨稳定低表达DNA 甲基转移酶3b（DNMT3b）基因对人膀胱癌细胞生长和凋亡的影响。方法包装表达
DNMT3b siRNA和阴性对照siRNA的慢病毒,通过慢病毒感染的方法获得稳定低表达DNMT3b的膀胱癌细胞BIU-87及对照
细胞。MTT和流式细胞仪检测DNMT3b稳定低表达对细胞增殖和凋亡的影响;体内裸鼠成瘤实验观察DNMT3b稳定低表达
对肿瘤的抑制效果;荧光定量PCR和Western blot检测DNMT3b稳定低表达对细胞生长和凋亡相关基因表达的影响;甲基化特
异性PCR检测对细胞生长和凋亡相关基因甲基化的影响。结果荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,DNMT3b mRNA
和蛋白水平在BIU-87稳定细胞株中稳定低表达;DNMT3b稳定低表达可以抑制BIU-87细胞的生长,并且抑制裸鼠皮下瘤体的
生长;DNMT3b稳定低表达可以促进BIU-87细胞的凋亡;DNMT3b稳定低表达可以增加凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax
和RASSF1A mRNA和蛋白水平的表达;DNMT3b稳定低表达可以减少凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax和RASSF1A启
动子区域的甲基化水平。结论DNMT3b稳定低表达可能通过调控凋亡相关基因以及细胞生长相关基因启动子区域的甲基化
水平来影响基因的表达,从而抑制BIU-87细胞的生长,诱导细胞凋亡。
     

人结肠癌细胞Dickkopf-1的表达水平及意义

目的检测六株结肠癌细胞中Dickkopf-1（DKK1）的表达并探讨其意义。方法在6株结肠癌细胞（SW480、SW620、HT29、
LS174T、LOVO、HCT116）分别应用qPCR方法检测DKK1的mRNA表达水平。用Western blot方法和细胞免疫组化方法检测
DKK1的蛋白表达情况。结果荧光定量分析显示,DKK1在HT29、HCT116中的表达高于其他四株细胞（P<0.05）;Western blot
显示,DKK1在HCT116、HT29中的表达同样高于其他四株细胞;细胞免疫组化染色显示,DKK1在六株结肠癌细胞株中呈阳性
表达。结论DKK1在6株人结肠癌细胞系中的表达具有差异性。
     

β-arrestin1激活JNK信号通路促进慢性髓细胞白血病细胞K562增殖

目的以CML K562细胞为研究对象,探索β-arrestin1促进CML细胞增殖的相关信号通路。方法以β-arrestin1慢病毒载
体感染CML K562细胞,形成稳定的K562-siβ1和K562-β1细胞,及非特异性siRNA对照K562-Ctrl细胞。以此为研究对象,利
用细胞计数与CCK-8实验检测细胞增殖能力;Western blot检测蛋白表达;免疫共沉淀（Co-IP）实验检测蛋白间的相互作用。结
果细胞计数与CCK-8 实验结果显示K562-β1 细胞增殖与细胞存活率能力显著高于K562-Ctrl,而K562-siβ1 显著低于
K562-Ctrl。Western blot结果表明β-arrestin1特异性增强磷酸化JNK表达,JNK抑制剂SP600125能抑制p-JNK表达和K562细
胞增殖;免疫共沉淀实验表明β-arrestin1 能与Src 结合。结论CML K562 细胞中β-arrestin1 与Src 结合,促进JNK信号通路激
活,从而促进细胞增殖。
     

钙稳态失衡在1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的研究钙稳态失衡在1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。方法MTT法检测细胞存活
率;Hoechst 33342 和Annexin V+PI 染色检测MPP+诱导人神经神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的凋亡作用;Western blot 检测
PARP蛋白表达的变化;罗丹明123 染色检测MPP+对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响;激光共聚焦显微镜检测MPP+对
SH-SY5Y细胞胞质钙、线粒体钙和内质网钙浓度的影响以及线粒体钙通道抑制剂钌红与MPP+联合应用对线粒体游离钙浓度、
胞质游离钙浓度的影响。结果MPP+导致SH-SY5Y细胞存活率下降且具有剂量-反应关系、MPP+能导致SH-SY5Y细胞凋亡、
MPP+导致SH-SY5Y细胞线粒体膜电位下降、MPP+使SH-SY5Y细胞胞质和内质网游离钙离子浓度下降而使线粒体游离钙离子
浓度上升。钌红可对抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、阻止线粒体膜电位下降,减少PARP的切割片段以及阻断线粒体游离
钙浓度的上升。结论线粒体钙超载在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中起重要作用。MPP+诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细
胞的凋亡可能与细胞质、线粒体及内质网的钙稳态失衡有关。
     

白蛋白和放置时间对细胞因子诱导杀伤细胞活性的影响及简易检测方法

目的研究细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）回输液中添加白蛋白和放置时间对其活性的影响,并建立简捷的CD3+CD56+细
胞生成率及细胞死亡率的检测方法。方法（1）抗CD3-FITC和抗CD56-PE同时标记CIK细胞,或FQ-AE染色CIK细胞,荧光显
微镜观察并记录;（2）悬浮液中加或不加白蛋白,Annexin V-FITC标记CIK细胞,不同时间段取样,流式细胞仪检测。结果（1）
食道癌患者CIK细胞集落小,散在分布;胰腺癌患者CIK细胞集落大且集中;（2）显微镜可观察并计数CD3+CD56+细胞;（3）回输
液中加与不加白蛋白的凋亡率及死亡率均无显著差异;（4）CIK细胞在培养箱外放置,0~90 min之间样品与150 min样品之间凋
亡细胞数差异显著,细胞死亡率与放置时间无显著差异。结论（1）不同肿瘤患者CIK细胞的生长集落不同;（2）抗CD3 和抗
CD56标记可计数CD3+CD56+CIK细胞生成率,FQ-AE染色可计数死亡细胞比率,检测方法简便、快捷;（3）CIK细胞回输液中可
不加白蛋白,对细胞存活率无影响;培养箱外放置时间90 min之内为宜,时间越短越好。
     

MicroRNA-218在肝细胞癌中的表达及功能

目的检测MicroRNA-218（miR-218）在肝细胞癌中的表达情况并研究其在肝癌中的功能。方法收集46例肝细胞癌及对
应癌旁组织,运用qRT-PCR技术检测miR-218 在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况;应用miR-218 mimic转染人肝癌细胞系
HepG2,MTT和流式细胞术检测转染后细胞活力和凋亡变化,qRT-PCR和Western blot检测miR-218潜在靶点的表达变化。结
果miR-218在肝癌组织中的表达显著低于对应的癌旁组织（P<0.05）;miR-218低表达与肿瘤大小（>5 cm）和高TNM分期（Ⅲ+
Ⅳ）具有显著相关性（P<0.05）;在HepG2细胞中,miR-218抑制细胞增殖和诱导凋亡,并下调Bmi-1和CDK6 mRNA及蛋白表达
（P<0.05）。结论miR-218低表达与肝癌的恶性临床病理特征相关,miR-218可能通过下调Bmi-1和CDK6表达抑制肝癌细胞增
殖和促进凋亡。
     

人Bcl-6 3’UTR区报告质粒及其表达载体的构建和功能检测

目的通过构建bcl-6 基因野生型、突变体3’UTR区及其编码序列（CDS）,观察miR-127 对bcl-6 的直接靶向调控作用及
bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利用PCR方法扩增bcl-6基因3’UTR区序列及其CDS,分
别构建在pcDNA3.0-Luc和pcDNA3.0-Flag载体上,在bcl-6基因3’UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点
突变的突变体报告基因质粒,应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用,在肝癌细胞HepG2中检
测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变,同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平,检测
bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确,bcl-6 3’UTR
野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和HepG2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报
告质粒的活性,但对突变体活性没有影响,miR-127可引起HepG2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长,bcl-6可以逆转miR-127
对细胞周期和细胞生长的影响。结论成功构建bcl-6基因3’UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体,荧光素酶
报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。