GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性影响研究

目的 研究GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性的影响。方法 以qRT-PCR和蛋白印迹法分别检测食管癌细胞系和正常食管上皮细胞GOLPH3 mRNA和蛋白水平,在OE33细胞中转染GOLPH3 siRNA,同时给予照射处理。MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞克隆实验检测放射敏感性,蛋白印迹法检测活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的Caspase-9(Cleaved Caspase-9)蛋白水平。结果 食管癌细胞中GOLPH3 mRNA和蛋白水平明显高于正常食管上皮细胞(P<0.05)。GOLPH3 siRNA可明显下调食管癌OE33细胞中GOLPH3 mRNA和蛋白水平。下调GOLPH3或者照射处理以后的食管癌细胞的增殖活性降低,细胞凋亡率升高,并且细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平也升高(P<0.05)。下调GOLPH3后的OE33细胞经照射处理以后,细胞增殖活性下降更多,细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高更多(P<0.05)。下调GOLPH3后OE33细胞经照射处理后,细胞放射增敏比为1.673。结论 GOLPH3在食管癌细胞中高表达,下调其表达可以增加OE33细胞放射敏感性,诱导细胞凋亡并抑制其增殖。     

盐酸罗哌卡因对胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨盐酸罗哌卡因对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。方法:细胞计数试剂盒（CCK-8）检测盐酸罗哌卡因对MGC-803细胞增殖能力的影响，并确定盐酸罗哌卡因的用药浓度，流式细胞术检测盐酸罗哌卡因对MGC-803细胞周期的影响，Annexin V-FITC/PI法检测盐酸罗哌卡因对MGC-803细胞凋亡的影响，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测盐酸罗哌卡因对MGC-803细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达水平。结果:随着盐酸罗哌卡因用药浓度的升高，MGC-803细胞增殖能力逐渐降低，根据CCK-8实验结果分别筛选出浓度为10、50 μg/ml和100 μg/ml的盐酸罗哌卡因用于后续实验。盐酸罗哌卡因能够明显阻滞细胞周期于G2期，诱导细胞凋亡，抑制Bcl-2蛋白表达，促进Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达。结论:盐酸罗哌卡因能够抑制胃癌MGC-803细胞增殖，阻碍MGC-803细胞周期进程，诱导细胞凋亡，该过程可能与下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达有关。     

miRNA-9对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡的作用及其机制

目的：通过提高骨肉瘤MG-63细胞miRNA-9的表达,探讨miRNA-9对MG-63细胞增殖及凋亡的影响及可能的作用机制。方法：MG-63细胞随机分为实验组、阴性对照组和空白组。实验组转染miR-NA-9（ Oligo）,阴性对照组转染阴性对照核苷酸序列（ microRNA negative control sequence）,空白组不做转染。qRT-PCR检测细胞miRNA-9、CXCR4的表达。CCK-8法检测3组细胞的增殖;流式细胞术比较3组细胞的凋亡水平。结果：与阴性对照组和空白组相比,转染组细胞中miRNA-9表达升高;miRNA-9高表达的骨肉瘤细胞增殖速率降低、细胞凋亡率增加、CXCR4 mRNA转录水平下调,差异有统计学意义。结论：CXCR4基因参与miRNA-9抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖过程,同时促进细胞凋亡。     

EGFR对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中STAT3磷酸化水平的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)对胃癌细胞SGC7901化疗敏感性及细胞中信号转导和转录因子3(STAT3)磷酸化水平的影响.方法:收集胃癌组织及对应的癌旁组织,体外培养胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1,Western blot检测胃癌组织、癌旁组织及胃癌细胞MKM28、SGC7901、BGC823和胃黏膜上皮细胞GES-1中EGFR的表达水平.细胞转染小干扰RNA对照序列(siRNA control组)和EGFR小干扰RNA(EGFR siRNA组),同时设置对照组(只加入转染试剂)、化疗组(细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶)、联合组(转染EGFR siRNA后的细胞,细胞培养液中加入8 μmol/L 5-氟尿嘧啶),培养48 h后,Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导和转录因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、EGFR表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:EGFR在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,在胃癌细胞中的表达水平明显高于胃黏膜上皮细胞.EGFR siRNA组细胞中EGFR水平明显降低.EGFR siRNA组、化疗组、联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于对照组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组。联合组细胞存活率及p-STAT3表达水平明显低于化疗组,而凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3水平明显高于化疗组。结论:EGFR在胃癌中过表达.抑制EGFR表达后,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增多,化疗敏感性增加,作用机制可能与STAT3磷酸化水平有关.     

PTTG1 siRNA增加塞来昔布对骨肉瘤细胞生长抑制作用的实验研究

目的:研究垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)siRNA和塞来昔布对骨肉瘤细胞生长的影响。方法:以不同浓度的塞来昔布处理骨肉瘤MG-63细胞，MTT方法测定细胞增殖和塞来昔布半数抑制浓度。用PTTG1 siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒感染MG-63细胞，用Realtime PCR和Western blot检测干扰效果。以半数抑制浓度的塞来昔布处理感染siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒的MG-63细胞，MTT法检测增殖，平板克隆实验检测克隆形成，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测细胞中活化的caspase-3（c-caspase-3）、活化的caspase-12（c-caspase-12）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)蛋白水平。结果:塞来昔布能够抑制MG-63细胞增殖，其半数抑制浓度约为85 μmol/L。siRNA慢病毒感染后细胞中PTTG1 mRNA和蛋白水平均低于对照慢病毒感染的MG-63细胞（P<0.05）。半数抑制浓度的塞来昔布或干扰PTTG1后的MG-63细胞增殖能力和克隆形成能力均降低，细胞凋亡增多，细胞中c-caspase-3、c-caspase-12和CHOP蛋白水平升高。干扰PTTG1的MG-63细胞经半数抑制浓度的塞来昔布处理以后，细胞的增殖和克隆形成能力均降低，细胞凋亡率及细胞中c-caspase-3、c-caspase-12、CHOP蛋白水平均升高，与单纯半数抑制浓度塞来昔布或干扰PTTG1的MG-63细胞比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论:PTTG1 siRNA增加塞来昔布对骨肉瘤细胞生长的抑制作用，其作用机制可能与内质网应激诱导的细胞凋亡有关。     

Kv1.3钾通道在骨肉瘤中的表达及作用研究

目的 探讨特异性短发卡RNA（shRNA）抑制Kv1.3钾通道对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting和免疫组化检测骨肉瘤MG-63细胞中Kv1.3钾通道的表达,并分别采用CCK-8法、裸鼠骨肉瘤异种移植模型和流式细胞仪检测MG-63细胞增殖、生长和凋亡的变化,采用Western blotting检测MG-63细胞中多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和caspase-3的表达水平。结果Kv1.3钾通道在骨肉瘤细胞中异常高表达。沉默Kv1.3钾通道的Ad5-Kv1.3-shRNA能从体内外有效地抑制MG-63细胞增殖并促进其早期凋亡。沉默Kv1.3钾通道可明显诱导细胞凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的裂解。结论Kv1.3钾通道参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡的过程,有望成为骨肉瘤治疗及诊断的新靶点基因。     

miR-106a下调MAP3K2抑制骨肉瘤细胞增殖的实验研究

目的:探讨miR-106a对骨肉瘤细胞增殖的影响及机制。方法:利用Real-time PCR比较了正常成骨细胞（hFOB11.9）及三种骨肉瘤细胞（MG-63、U-2OS和HOS）中miR-106a的表达情况；将NC（negative control)、miR-106a mimics及miR-106a inhibitor分别转染MG-63细胞；转染后通过CCK-8实验、平板克隆形成实验检测miR-106a对细胞增殖的影响；通过生物信息学软件预测miR-106a的靶基因-蛋白激酶2（MAP3K2）；分别构建MAP3K2 3'-UTR结合区野生型和突变型载体，通过荧光素酶报告基因实验检测miR-106a对MAP3K2的调控；在转染了NC以及miR-106a mimics的MG-63细胞中，利用Western blot检测MAP3K2的蛋白水平。结果:与正常成骨细胞相比，骨肉瘤细胞MG-63、U-2OS和HOS中miR-106a的表达明显降低（P＜0.05）；CCK-8生长曲线表明，转染48、72和96小时后，与NC相比，miR-106a mimics能够显著抑制MG-63细胞的生长（P＜0.05），而miR-106a inhibitor则能促进肿瘤细胞的生长（P＜0.05）;平板克隆形成实验也表明miR-106a mimics能够抑制MG-63的生长，miR-106a inhibitor发挥相反作用；荧光素酶报告基因实验表明转染了克隆MAP3K2 3'-UTR的荧光素酶质粒组中，荧光素酶活性受到miR-106a mimics的明显抑制（P＜0.05），而在MAP3K2 3'-UTR突变组中，荧光素酶活性与对照相比无显著差异（P=0.877）；与NC组相比，转染miR-106a mimics后，MAP3K2的表达明显降低（P＜0.05）。结论:miR-106a可能通过下调MAP3K2的表达抑制骨肉瘤细胞的生长。     

miR-369靶向调节SOX4表达对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用

目的:观察微小RNA（miRNA,miR）-369通过调节SOX4对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡的影响。方法:miR-369体外模拟物（mimics）转染,构建miR-369上调表达模型,以转染阴性对照链为对照组,CCK-8法和流式细胞技术分别检测细胞增殖率和凋亡率变化;Real-time PCR法检测SOX4 mRNA表达水平;双荧光素酶活检检测证实miR-369与SOX4相互作用关系;Western-blot法检测不同组间SOX4及Bcl-2家族相关蛋白表达水平变化。结果:miR-369 mimics转染后,MG-63细胞中miR-369表达水平较对照组明显提高(P=0.009);miR-369 mimic转染后24 h及48 h后细胞相对存活率均明显低于对照组;流式细胞仪结果显示mimic组细胞凋亡率较对照组明显提高（P=0.031）;Real-time PCR和Western blot实验分别证实miR-369 mimic转染后,SOX4在mRNA和蛋白水平表达均明显抑制;而Bcl-2家族相关蛋白表达水平发生明显变化。结论:miR-369表达上调可以抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡,这些作用与靶向下调SOX4表达有关。     

集缩素NCAPG表达对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及可能机制

目的:探讨集缩素NCAPG表达与甲状腺癌B-CPAP细胞增殖和凋亡的关系及可能的调控机制。方法:利用siRNA-NCAPG下调B-CPAP细胞NCAPG的表达，分别采用qRT-PCR、Western blot法检测转染组与对照组的NCAPG基因及蛋白表达量。CCK-8法检测各组细胞的增殖能力，观察NCAPG对细胞增殖的影响。为探讨NCAPG对B-CPAP细胞凋亡的影响，利用流式细胞术检测各组细胞Annexin V／PI双染情况，利用Western blot法检测各组细胞的凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2表达。结果:转染siRNA-NCAPG的B-CPAP细胞成功下调NCAPG的基因及蛋白表达。NCAPG表达下降抑制B-CPAP细胞的增殖。流式细胞术结果显示，下调NCAPG表达可诱导B-CPAP细胞凋亡。Western blot结果表明，下调NCAPG表达促进B-CPAP细胞Caspase-3和Bax的表达，抑制Bcl-2的表达。结论:甲状腺癌细胞B-CPAP中NCAPG促进细胞增殖，抑制其表达后可通过调节线粒体通路诱导细胞凋亡。     

EphA7在骨肉瘤中的表达及对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响

背景与目的：EphA7蛋白是对人体正常生理过程具有重要作用的一种膜蛋白，常在细胞膜中发挥多种调控作用，但该蛋白在骨肉瘤中的作用尚不清楚。该研究拟观察骨肉瘤组织中EphA7的表达，并了解EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法：收集45例患者的骨肉瘤组织和瘤旁正常组织。培养人骨肉瘤MG-63细胞，用siRNA转染MG-63细胞，并分成siRNA-EphA7组（EphA7-siRNA转染）、siRNA-Control组（阴性对照siRNA转染）和空白组（未转染）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）评估组织和细胞中EphA7的mRNA表达和蛋白水平。通过细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）测定细胞增殖活力，通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力，利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果：RTFQ-PCR和Western blot检测结果显示，EphA7的mRNA表达和蛋白水平在骨肉瘤组织中明显高于瘤旁正常组织（P＜0.05）；与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组中EphA7的mRNA表达和蛋白水平显著降低（P＜0.05）。CCK-8测定结果显示，siRNA-EphA7组的吸光度（D）值显著低于空白组和siRNA-Control组（P＜0.05）。细胞划痕实验显示，与空白组和siRNAControl组相比，siRNA-EphA7组在划痕后愈合率显著降低（P＜0.05）。流式细胞术显示，与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组凋亡率显著增加（P＜0.05）。结论：EphA7在骨肉瘤组织中表达上调。下调MG-63细胞中EphA7的表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移，促进其凋亡。     

沉默HOXC10基因促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其机制

目的:探讨沉默同源框C10（Homeobox C10,HOXC10）基因表达对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:采用脂质体转染法将特异性针对HOXC10基因的shRNA转入骨肉瘤MG-63细胞（HOXC10-shRNA组）,同时以转染Scramble-shRNA作为对照组（Scramble-shRNA组）,分别应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HOXC10 mRNA及蛋白的表达水平。转染处理后,分别采用CCK-8法及FCM法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率及凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测HOXC10、ATM和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)及凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达水平。结果:HOXC10-shRNA转入MG-63细胞后,HOXC10 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。与Scramble-shRNA组细胞活力（0.95±0.12）%和凋亡率（4.35±0.52）%相比,HOXC10-shRNA组细胞活力（0.38±0.06）%明显下降,细胞凋亡率为（18.19±3.76）%明显升高（P均<0.05）;ATM/NF-κB信号通路中相关蛋白ATM、NF-κB及Survivin的表达水平均明显下调（P均<0.05）,而Caspase-3表达明显上调（P<0.05）。结论:沉默HOXC10基因表达后可抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控ATM/NF-κB信号通路的活化相关。     

HIF-1α抑制剂YC-1对人骨肉瘤细胞Saos2和U2-OS增殖和凋亡的影响

目的:应用缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）抑制剂YC-1处理人骨肉瘤细胞Saos2和U2-OS，观察不同药物浓度对人骨肉瘤细胞系Saos2和U2-OS细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响及其机制。方法:人骨肉瘤细胞系Saos2和U2-OS分对照组和实验组。对照组细胞1%氧气浓度低氧培养，实验组细胞施加HIF-1α抑制剂YC-1干预，设浓度梯度。CCK-8法检测不同药物浓度对Saos2和U2-OS细胞活力及增殖的影响；流式细胞术检测YC-1对Saos2和U2-OS细胞周期和凋亡的影响；Western blot对FXR1、G3BP1、APAF1、Cleaved Caspase-3蛋白的表达进行相对定量分析。结果:CCK-8检测结果显示，YC-1对人骨肉瘤Saos2和U2-OS细胞有显著的增殖抑制作用，且呈明显的剂量依赖效应。不同浓度的YC-1处理细胞后，均可使各处理组G1期细胞增多，S期细胞减少，且呈剂量依赖效应(P＜0.05)。不同浓度的YC-1处理细胞后，与对照组相比，各实验组FXR1、G3BP1、APAF1蛋白表达显著下降(P＜0.05)，而Cleaved Caspase-3蛋白表达显著增高(P＜0.05)。结论:YC-1可以将人骨肉瘤细胞株Saos2和U2-OS细胞阻滞于G1期，影响细胞周期进程，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。HIF-1α对人骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响可能是通过上调FXR1、G3BP1、APAF1的表达而实现，而YC-1抑制了HIF-1α的表达从而使Cleaved Caspase-3的表达增高诱导细胞凋亡。HIF-1α及FXR1、G3BP1、APAF1、Cleaved Caspase-3有望成为骨肉瘤治疗的新靶标。     

STAT3信号通路抑制剂AG490协同TCF21促进卵巢癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨信号转导与转录因子3(STAT3)信号通路抑制剂AG490对过表达转录因子21(TCF21)的卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:卵巢癌细胞ES-2转染TCF21过表达载体,Western blot检测转染后细胞中TCF21表达情况。ES-2细胞分为对照组(未转染且正常培养)、过表达组(转染TCF21过表达载体)、抑制剂组(未转染的细胞经过STAT3信号通路抑制剂处理)、联合组(STAT3信号通路抑制剂处理过表达TCF21的细胞)。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、剪切后的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果:转染TCF21过表达载体的ES-2细胞中TCF21表达水平升高明显高于对照组(P<0.05)。过表达组和抑制剂组细胞增殖率和p-STAT3/STAT3水平明显低于对照组且明显高于联合组(P<0.05)。过表达组和抑制剂组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组且明显低于联合组(P<0.05)。结论:STAT3信号通路抑制剂能够协同TCF21促进卵巢癌细胞凋亡并抑制卵巢癌细胞增殖。     

赖氨酸去甲基化酶5C抑制剂CPI-455对ESCC细胞系 Eca-109增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的:本研究探讨赖氨酸去甲基化酶5C（lysine demethylase 5C,KDM5C）抑制剂CPI-455对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系Eca-109增殖、凋亡的影响及其机制。方法:运用MTT法、平板克隆形成实验检测 CPI-455对Eca-109细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察CPI-455对Eca-109细胞线粒体内部超微结构的影响;流式细胞仪检测CPI-455诱导Eca-109细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blot测定CPI-455对Eca-109细胞中p53、Bax、KDM5C、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的影响。结果:MTT法、平板克隆形成实验结果分析显示:CPI-455能够抑制Eca-109细胞的增殖,具有时间、浓度依赖性,差异有统计学意义（P均＜0.01）;电镜下观察Eca-109细胞内结构显示:CPI-455引起Eca-109细胞中的线粒体固缩,线粒体缩小,结构紧密;流式细胞术和Western blot显示:CPI-455可以上调Eca-109细胞中ROS含量、p53、Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的蛋白表达,同时下调KDM5C蛋白表达（P＜0.05）。结论:CPI-455具有抑制Eca-109细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用,其作用机制可能与下调KDM5C蛋白的表达有关。     

RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖、抑制其凋亡的相关研究

目的:探究RNA干扰RhoBTB1基因表达对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用Lipofectamine 2000将siRNA RhoBTB1或siRNA NC转入HT29细胞中，实验分为Control组、转染对照组和siRNA Rho组，噻唑蓝（MTT）和流式细胞术分别检测细胞的的活力和凋亡率，蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞中RhoBTB1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达量。结果:与对照组相比，HT29细胞转染siRNA RhoBTB1后，细胞中RhoBTB1蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05），细胞活力显著升高（P<0.05），凋亡率显著降低（P<0.05），Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著增加（P<0.05）。结论:RNA干扰RhoBTB1表达促进结肠癌HT29细胞增殖，抑制其凋亡，可能通过调节线粒体凋亡通路相关蛋白的表达量发挥作用。