对流免疫电泳及反向间接血凝技术检测鸭血清中DHBsAg

卫生系流行病学教研室李笠教授等用CsCl 密度梯度离心法提纯鸭血清中鸭乙型肝炎病毒表面抗原(DHBsAg),以纯化DHBsAg 加弗氏佐剂免疫家兔,采集分离兔血清,并经正常鸭血清吸附后,     

鸭乙型肝炎病毒表面抗原的纯化及应用

目的：从鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）感染鸭血清中纯化表面抗原（ＤＨＢsAg),初步应用于病毒感染后复制的研究。方法：用蔗糖密度梯度离心纯化病毒表面抗原,经Bradford法定量血清中该蛋白含量;建立DHBsAgELISA检测方法,并与DHBVDNA斑点杂交相比较。结果：纯化DHBsAg经ELISA检测OD490nm≥1.0,Western杂交显示主要肽分子量为17KDa和35KDa:Bradford法定量血清蛋白含量为2.85-5.10ug/ml,DHBsAgELISA检测100份血清标本阳性数为84例,斑点杂交检测阳性数为88例,两者吻合率为94%。结论：DHBsAg的制备及ELISA方法的建立,为进一步研究病毒感染后复制及体内免疫应答状况奠定了基础。     

一种快速、简便检测鸭乙型肝炎病毒抗原、抗体的方法

本文报道检测鸭乙型肝炎表面抗原(DHBsAg)及抗体的斑点酶免疫测定法(Dot Euzyme Immunoassay,Dot EIA)。以硝基纤维素膜为载体依次加被检血清、抗DHBV免疫血清、辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA-酶结合物),可测标本中DHBsAg。依次加纯化DHBV、被检血清、SPA-酶结合物则可测血清中抗体及效价。用此法检测自然感染鸭血清40份,实验感染鸭血清220份,并与DHBV核酸斑点杂交法比较分析,两种方法符合率94.2％。用本方法测定本室制备的兔抗DHBV免疫血清,抗体效阶为1/3200。Dot EIA简单、快速、敏感、特异,是研究DHBV较有实用价值的一种方法。     

东北家鸭乙型肝炎病毒同人的乙型肝炎病毒交叉反应的研究

本文对东北局部地区麻鸭乙型肝炎病毒(DHBV)和肝病进行检测,证实东北家鸭存在DHBV感染。血清学检测,采用固相放射免疫法和DNA探针,结果表明,DHBsAg与HBsAg和DHBcAb和HBcAb有交叉反应,DHBV DNA与HBV DNA可以杂交。血清交叉反应阳性鸭血清免疫电镜见病毒颗粒聚集成团或互相连结成串。病理组织学检查表明本组家鸭DHBV携带状态与非携带状态肝病无显著差异。同时本文也发现DHBV与HBV的交叉反应检测受检测试剂盒的影响。     

乙型肝炎病毒免疫耐受动物模型的建立与验证

用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染1d龄幼鸭建立了乙型肝炎免疫耐受动物模型,随访22周,鸭乙型肝炎病毒表面及前表面抗原(DHBs/presAg)及DHBV DNA阳性不变。在持续性感染鸭血清中未能检出抗DHBs/pres或抗鸭乙型肝炎核心(DHBc)抗体。用纯化的DHBs/pres Ag及DHBcAg与鸭外周血淋巴细胞作特异性淋巴细胞增殖试验,结果也未见阳性反应。以DHBs/presAg及DHBcAg分别免疫上述免疫耐受鸭,每3周1次。连续免疫5次,也未能刺激产生相应的抗体及特异性淋巴细胞增殖反应,从而首次建立并确证了1d龄鸭感染DHBV导致的免疫耐受动物模型。     

鸭乙型肝炎病毒在天然宿主中的特异性体液及细胞免疫应答

用灭活的鸭乙型肝炎病毒免疫健康成年鸭，观察鸭外周血淋巴细胞的增殖，同时用间接ＥＬＩＳＡ法检测免疫鸭血清中抗ＤＨＢ／ｓｐｒｅｓ和抗ＤＨＢｃ。结果发现，在２次免疫后，４只鸭均产生低滴度的抗ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓ，抗ＤＨＢｃ仅在１只鸭中一过性地出现，４只鸭中３只于第三次免疫后出现对ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓＡｇ的淋 产殖反应，２只出现对ＤＨＢｃＡｇ的增殖反应。     

丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化

目的:表达和纯化丙型肝炎病毒(HCV)-Core、NS3和NS4的His融合抗原H-C、H-NS3和H-NS4,并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法:用重组基因工程技术,构建3种重组质粒C-pET-28a-c( )、NS3-pET-28a-c( )和NS4-pET-28a-c( )以及相应的工程菌;质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后,IPTG诱导抗原表达,从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件;用NTA柱纯化抗原后,分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果:用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中,H-C、H-NS3和H-NS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%,而H-C、H-NS3和H-NS4混合抗原的抗体检出率为100%;检测40份健康人血清,结果全部为阴性。结论:HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率,但均低于混合抗原的阳性率;在开发HCV抗体诊断试剂时,应采用HCV混合抗原。     

鹅血清中发现鸭乙型肝炎病毒样颗粒

用DNA斑点杂交、电镜、免疫电镜和斑点酶免疫法(Dot EIA),在鹅血清中发现一种与鸭乙型肝炎病毒(DHBV)相似的病毒颗粒。用DNA斑点杂交法和Dot EIA在鹅群中测得DHBV DNA和DHBsAg的阳性率均为32.43%(12/37)。对阳性血清进行电镜观察,见到直径30～60nm的球型颗粒,形态与DHBV相似。抗DHBsAg能使病毒颗粒发生凝聚。用CsCl密度梯度法对DHBV阳性血清进行超速离心,发现病毒颗粒分布在1.16～1.24g/ml的密度范围内,与DHBV的密度范围(1.15～1.25g/ml)接近一致,表明鹅血清中的病毒颗粒,不仅在形态学上与DHBV相似,且核酸序列与DHBV也有同源性,由其编码产生的表面抗原成分与DHBsAg有共同的抗原性。作者提出,这种病毒可能是1.独立存在于鹅体内的一种新的DNA病毒,与肝脏的关系有待探讨;2.作用于不同宿主的DHBV;3.DHBV的不同亚型。     

逆向斑点杂交.斑点杂交和电镜检测鸭乙型肝炎病毒的比较

本文将逆向斑点杂交同时检测鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV DNA)及其特异DNA多聚酶(DNAp)的结果,与斑点杂交检测DHBV DNA和电镜检测DHBV颗粒的结果作了比较。174份鸭血清用逆向斑点杂交和斑点杂交进行了配对检测,两者结果在统计上无差别。77份用逆向斑点杂交和电镜作了配对检测,结果也无统计学差别。部分样品用三种方法重复检测多次,结果以逆向斑点杂交检测的重复性最好。并认为逆向斑点杂交具有方法简单、可靠、重复性好和一次能同时检测DHBY DNA和特异DNAp两个指标的优点,是研究体内嗜肝病毒复制较为理想的方法。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

乙肝病毒外膜大蛋白检测在诊断乙型病毒性肝炎中的临床意义

目的通过检测乙肝患者血清中乙肝病毒外膜大蛋白(HBV-LP)、HBV、DNA、以及乙肝两对半(HBVM),探讨HBV-LP与HBVDNA浓度的相关性.方法共检测354例乙肝患者血清标本,HBV-LP、乙肝前S1蛋白(Pre-SlAg)以及乙肝两对半采用酶联免疫方法进行检测,采用实时荧光定量PCR方法检测HBV DNA.结果(1)在290份HBV DNA阳性标本中HBV-LP的阳性率(88.62%)明显高于乙肝病毒前S1的阳性率(48.97%),两者之间差异有显著性(P＜0.05);(2)HBV-LP吸光度值与HBV DNA拷贝数呈正相关性,相关系数r=0.939;(3)在HBeAg阳性和阴性标本中,Pre-SlAg的检出率则明显低于HBV-LP和HBV DNA.结论本研究结果显示HBV-LP与HBV DNA有良好的正相关性,HBV-LP检出与HBV DNA的符合率高于Pre-SlAg,HBV-LP检测可以用于反映乙肝患者病毒复制的血清免疫学指标.     

HBV前C区1896位点变异与HBV感染者肝功能损害程度的关系

了解ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点变异与乙型肝炎病毒感染者肝功能损害程度的关系。方法：用ＰＣＲ技术，通过改变引物３’端的方法，检测ＨＢＶ感染者的前Ｃ区第１８９６位点变异株。结果：１０５例ＨＥＶ感染者中的ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点变异株总检出率为５６．２％；男性与女性患者的检出率分别为５７．０％与５００％；≤３０岁组，３１－５９岁组，≥６０岁年龄组的检率分别为６０．０％，５６．６％，２８．６％；无黄疸组，轻～中度黄疸组，重度黄疸组的检出率分别为５３．２％，６５．１％，４０．０％；在ＨＢＶ携带者、慢性肝炎（包括轻、中、重庆），重症肝炎及肝硬化患者中的检出率分别为６０．０％，５７．４％，３３．３％，７０．０％。结论：ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点突变株广泛存在于ＨＢＶ感染者中，而且其检出率与患者性别、年龄、ＨＢＶ感染时间长短及肝功能损害程度并无明显联系。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

心脏手术对乙肝及乙肝病毒携带者肝功能的影响

目的观察体外循环心脏手术对乙肝（HB）及乙肝病毒（HBV）携带者肝功能的影响。方法对心脏病手术患者于手术前后进行了肝功能测定，其中肝功能正常组45例、HBV携带组42例，HB组18例。结果体外循环对HBV携带者的肝功能无显著影响（P〈0．05），对其术后出血也无明显影响。HB患者体外循环术后谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）显著升高，且其术后出血量较肝功正常者明显增加（P〈0．05）。结论术前肝功能正常的乙肝病毒携带者接受心脏手术是安全的．HB患者心脏手术中肝功能损害是可逆性的，只要采取必要的保护措施也可以接受手术治疗．     

乙型肝炎病毒S1抗原检测及其与HBeAg的关系探讨

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与HBeAg及HBV在体内复制和感染的存在关系。方法采用ELISA法对280例乙肝肝炎病毒感染者中HBeAg阳性患者血清进行前S1抗原检测。结果乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原在血清学表达上与HBeAg的阳性符合率高达91.43％。结论乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与HBeAg平行存在,是乙型肝炎病毒在体内存在的复制和感染的可靠指标。     

阿德福韦酯耐药患者HBV基因型的相关分析

目的探讨慢性乙型肝炎、肝硬化患者阿德福韦酯治疗过程中出现耐药变异与HBV基因型的关系,为优化临床抗病毒治疗提供依据。方法对近年来山西地区122例慢性乙型肝炎、肝硬化患者阿德福韦酯抗病毒治疗过程中出现病毒学反弹患者,采用巢式PCR法检测血清HBV基因型;采用巢式PCR-DNA测序法检测患者血清标本HBVDNA位点,观察是否存在rtA181V/rtN236T变异,并分析其与基因型的关系。结果 122例患者中B基因型7例占5.74%;C基因型115例,占94.26%;在性别上,B、C基因型差异均无显著性意义（P〉0.05）;C型肝硬化率明显高于B基因型（P〈0.05）;均发生了rtA181V和/或rtN236T位点变异。结论 C基因型可能与阿德福韦酯耐药变异及肝硬化关系密切。     

PreS1Ag与HBV-DNA、乙肝病毒＂两对半＂的相关分析

目的 探讨乙肝病毒前S1蛋白抗原（PreS1Ag）、乙肝病毒基因（HBV-DNA）和乙肝＂两对半＂检测的相关性及在乙肝诊治中的价值.方法 PreS1Ag和乙肝＂两对半＂检测采用酶联免疫法,HBV-DNA检测采用荧光定量PCR扩增技术.结果包括HbeAg阳性的2种组合中,HBV-DNA和PreS1Ag阳性率分别为87.1%、86.0%和100.0%、100.0%,HBV-DNA和PreS1Ag,在不包括HbeAg阳性的3种组合中,HBV-DNA和PreS1Ag阳性率分别为42.3%、45.7%;46.3%、44.8和11.1%、11.1%.HBV-DNA检测阳性标本中,PreS1Ag的阳性率为87.2%,HbeAg阳性率为75.6%;二者联合检测阳性率为96.5%,HBV-DNA检测阴性标本中PreS1Ag和HbeAg的阳性率为7.8%和5.2%,二者联合检测阳性率为9.5%.结论 PreS1Ag检测联合乙肝＂两对半＂检测是乙型肝炎早期诊断和评价疗效的可靠指标,可在临床推广应用.     

云浮市2001～2005年健康人群乙肝病毒感染分析

目的了解云浮市健康人群乙肝病毒（HBV）感染率及免疫水平，探讨健康人群乙型肝炎防控对策和措施。方法采集43890人健康人群血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc5项标志物（HBVM），并按年龄、性别分组进行分析比较。结果HBsAg总阳性率为16．9l％，其中男性为17．80％，女性为16．20％，差异有显著性（P〈0．01）；HBeAg总阳性率为6．46％，其中男性为6．60％，女性为6．34％，差异无显著性（P〉0．05）；抗-HBs总阳性率为43．03％，其中男性为35．73％，女性为48-88％，差异有显著性（P〈0．01）；HBVM全阴率为20．58％，其中男性为26．76％，女性为15．63％，差异有显著性（P〈0．01）；各年龄组间抗-HBs阳性率差异有显著性（P〈0．01）。结论人群中HBV感染率高，易感者多，免疫水平较低，应加强成人乙肝疫苗接种工作，扩大免疫屏障．降低发病率。     

乙型肝炎病毒基因变异与临床

HBV在多种因素影响下发生基因变异,以实现自身生存的目的。乙型肝炎病毒(HBV)基因变异对慢性乙型肝炎患者病情发展、严重程度以及对抗病毒治疗效果都有一定的影响。随着聚合酶链反应及其扩增产物直接测序等分子生物学技术的应用和发展,使人们能够从分子水平认识病毒及其变异,包括HBV不同基因区段变异的频率和类型。本文就HBV基因变异、临床意义及其检测方法的最新研究进展做一综述。     

乙肝疫苗单用或与HBIG联用阻断配偶间乙型肝炎病毒感染的研究

目的探讨有效阻断乙型肝炎病毒在配偶间传播的免疫方案。方法随机抽取全省13个市县在婚前医学检查中筛查出HBsAg阳性、HBeAg阳性且肝功能正常的255例携带者的配偶为研究对象,其肝功能正常且乙肝血清标志物均阴性。将研究对象随机分成3组:联合免疫组、单纯乙肝疫苗免疫组和对照组,对各组采取不同的免疫方案,12个月后分别检测研究对象的肝功能和乙肝血清标志物,并对其进行问卷调查。结果12个月后,联合免疫组和单纯乙肝疫苗免疫组HBsAb阳性率均明显高于对照组,而HBsAg阳性率明显低于对照组,差别有显著性意义(P<0.001),联合免疫组与单纯乙肝疫苗免疫组HBsAb阳性率间差别无显著性意义(P>0.05)。各组HBsAb阳性率及HBsAg阳性率男、女间差别无显著性意义(P>0.05)。除联合免疫组外,单纯乙肝疫苗免疫组和对照组的HBsAg阳性率城乡间差别有显著性意义(P<0.05),农村被检者HBsAg阳性率高于城市。结论全程单纯接种乙肝疫苗或与乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)联合注射能使大多数人产生乙肝表面抗体(HBsAb),可有效阻断HBV在配偶间的传播。HBIG在保护那些在完成免疫全程前已结婚或婚前短时间同居的配偶时起到了关键作用。