骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化***★

背景：传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱，并进行支架材料的双面种植，但由于平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限，双面种植较为困难。 目的：实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性。 设计：基础实验研究。 单位：中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心。 材料：实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。实验室级别为卫生部部属医院开放实验室。1月龄SD大鼠，雌雄不限，体质量80~ 100g，由中山大学实验动物中心提供。新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心。 方法：采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，并应用流式细胞仪检测其表面抗原。采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质，并测定其纯度及特性。将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上，以添加25 ng/L血管内皮生长因子（VEGF165）的培养液进行体外、体内复合培养，检测其相容性。体内实验以细胞单独培养为对照，体外实验以未植入细胞的材料为对照，并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化，分别在4，8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查，并进行免疫组织化学角蛋白染色，检测上皮细胞再生情况。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性。 结果：①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞，行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示，传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%。②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性，镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维。体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性，细胞生长状态良好。③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润，胶原及弹性纤维排列紧密，免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长，8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应，胶原及弹性纤维排列紧密，免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长。 结论：骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性，并且在体内与周围组织有良好的生物相容性，可以作为构建组织工程膀胱的材料。     

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架的细胞相容性☆

背景：作者所查目前尚未见应用灌注法制备大鼠全肾脱细胞基质的相关报道，制备的脱细胞基质是否具有良好的细胞相容性尚不确切。 目的：应用灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架，检测鼠肾脱细胞基质与L929细胞的细胞相容性，探讨灌注法制备的肾脱细胞基质作为细胞支架构建泌尿系实质性组织工程器官的可行性。 设计、时间及地点：体外细胞水平观察实验，于2009-02/05在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。 材料：取12周龄Wistar大鼠的肾脏，保留输尿管、肾静脉及肾动脉，沿肾动脉插入留置针建立灌注通道。灌注压强为9.81 kPa，依次灌注肝素化PBS溶液，1%十二烷基磺酸钠溶液，去离子水，1% TritonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液，制备全肾脱细胞基质支架。 方法：①设立空白组(无细胞)、阴性对照组(培养基)和实验组(鼠肾脱细胞基质浸提液)及阳性对照组(含0.64%苯酚溶液的培养基)。取对数生长期的L929细胞，4×103/孔接种于96孔板中，每组各5孔，于接种24，72，120 h，通过MTT法显色，于酶标仪490 nm波长下检测吸光度值，计算相对增殖率。②设立对照组(培养基)、实验组(鼠肾脱细胞基质浸提液)及阳性对照组(含0.64%苯酚溶液的培养基)，培养48 h后应用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。 主要观察指标：①支架微观结构。②细胞毒性。③细胞凋亡率。 结果：脱细胞基质支架扫描电镜观察仅见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞残留，24，72，120 h实验组吸光度值与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。脱细胞基质细胞毒性为0级和1级。实验组与阴性对照组之间细胞凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：大鼠全肾脏脱细胞基质支架具有良好的细胞相容性。 关键词：肾脏；脱细胞基质；细胞毒性；凋亡；组织工程     

无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特征

背景：前期研究表明，无细胞基质的组织工程膀胱支架材料有良好的生物相容性，无毒可吸收，符合组织工程生物支架材料的部分应用要求。 目的: 实验拟进一步观察无细胞基质组织工程膀胱生物支架材料的生物力学特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2006-07/2007-05在中国医学科学院北京协和医院中心实验室和北京大学高分子科学与工程系完成。 材料：新鲜猪膀胱。 方法:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱组织进行脱细胞处理，制备无细胞基质膀胱。对新鲜猪膀胱组织及制备的膀胱无细胞基质行苏木精-伊红染色和Masson染色。 主要观察指标：测定膀胱组织在脱细胞前后组织的厚度、组织含水量、可溶性蛋白含量、最大位移、最大应力和断裂应力。 结果: 与新鲜膀胱组织相比，脱细胞后的膀胱组织中未见有细胞成分，保留了完整的细胞外基质。膀胱组织含水量在脱细胞后明显增加（P < 0.001），组织厚度和可溶性蛋白含量明显降低，而经校正后的应力－应变参数及破坏强度则改变不明显。 结论:无细胞基质膀胱与天然组织的生物力学特性一致或接近。     

原代培养干细胞前脂肪组织的纯化*★

背景：脂肪干细胞是目前组织工程研究中的热点种子细胞，但由于其缺乏特异性的表面标记，故目前尚缺乏有效的纯化方法。通过纯化取材的脂肪来提高干细胞纯度是一种简单可行的方法。 目的：分析在原代培养脂肪干细胞前，如何对取材的脂肪组织进行纯化。 设计、时间及地点：观察对比动物实验，于2007-12/2008-03在上海市第六人民医院上海市实验医学动物中心完成。 材料：选用4周龄SD大鼠，用于获得腹股沟处的脂肪组织。 方法：解剖SD大鼠腹股沟处取材的脂肪组织，游离出其表面血管及内部的血管分支。剔除内部血管的同时将分布在血管周围的椭圆形结节组织一并切除。 主要观察指标：对椭圆性结节行苏木精-伊红染色，显微镜下观察以确定其组织类型。分别对经过纯化处理和未纯化处理的脂肪组织行苏木精-伊红染色，显微镜下观察其组织结构上的差异。 结果：①椭圆性小结节经苏木精-伊红染色后在显微镜下观察证实为淋巴组织。②纯化的脂肪组织结构一致，细胞成分单一；未纯化的脂肪组织结构紊乱，细胞种类多样、成分复杂。 结论：脂肪干细胞原代培养所用的脂肪组织中含有多种组织成分，在剔除脂肪组织表面的血管、皮肤和肌肉组织的同时应一并剔除组织内的血管及其周围淋巴结。     

脱细胞血管基质制备及体内外生物相容性

背景：利用脱细胞血管基质作为血管支架具有以下优点：脱细胞血管基质保留了自然血管的复杂三维结构;脱细胞基质表面的生长因子和结构域有利于细胞的黏附和浸润。 目的：制备脱细胞血管基质并对其体内外生物相容性进行评价。 方法：采用胰蛋白酶、Triton X-100逐步处理猪颈动脉制备脱细胞血管基质。采用皮下植入实验、急性毒性实验和体外细胞毒性实验等评价其生物相容性。 结果与结论：脱细胞基质材料具有良好的化学稳定性,未释放对红细胞产生破坏溶解作用的有害元素,未引起急性溶血反应,对细胞的生长无毒性影响。脱细胞基质材料在动物体内植入后早期有较多炎性细胞浸润,到实验观察的后期无明显炎性细胞浸润,脱细胞基质内可见成纤维细胞。另外,脱细胞基质材料对周边组织未产生毒性作用,伤口Ⅰ期愈合。同时组织学切片显示：支架材料与周边组织相容性好,未产生排斥反应。说明脱细胞基质材料在动物体内具有很好的生物相容性。 关键词：血管支架;生物相容性;生物材料;脱细胞血管基质;相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.16.010     

人脐静脉脱细胞基质的制备

摘要 背景：细胞外基质的制备以去除组织中的细胞成分为目的，目前脱细胞方法尚无统一的标准，但是制备的细胞外基质均需证实有无细胞残留。 目的：观察应用酶消化、去污剂、渗透溶液方法和TritonX-100与氨水混合液方法制备脐静脉脱细胞基质的效果，以探讨制备人脐静脉脱细胞基质的理想方法。 方法：分别采用酶消化、去污剂、渗透溶液法和曲拉松与氨水混合液两种方法处理人脐静脉，制备人脐静脉脱细胞基质。观察脱细胞处理前后脐静脉基质的物理性状和苏木精-伊红染色结果，随机观察50个400倍镜像下残留细胞碎片数目。 结果与结论：脐静脉经脱细胞处理后呈瓷白色半透明胶冻样管状结构。酶消化、去污剂、渗透溶液方法组的人脐静脉细胞成分几乎全部去除，细胞外基质保持完好，纤维结构完整，曲拉松与氨水混合液方法组有不同数量的残余细胞成分，两组差异具有显著性意义(P < 0.05)。结果表明，酶消化、去污剂和渗透溶液法是制备人脐静脉脱细胞基质较为理想的方法。 关键词：细胞外基质；人脐静脉；制备；组织工程；酶消化；去污剂；渗透溶液 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.011     

膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作用☆

目的：环境因素对干细胞的分化起到重要的作用。实验拟观察经低浓度二甲亚枫进行预诱导后，大鼠骨髓间充质干细胞在体外经膀胱组织匀浆上清液诱导定向分化为平滑肌样细胞的可行性。 方法：实验于2007-04/2007-09在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成。①实验材料：4～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠1只，雌雄不限，8周龄220~250 gSD大鼠4只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，并在体外扩增、传代。选择8周龄SD大鼠进行膀胱组织上清液的制备。取第4代骨髓间充质干细胞用1%二甲亚砜预诱导8 h后，应用膀胱匀浆上清液诱导7 d。以未进行诱导的骨髓间充质干细胞为阴性对照组。③实验评估：观察细胞形态学的变化，并运用免疫细胞化学检测特异性α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。 结果：骨髓间充质干细胞经诱导分化后，细胞呈梭形平滑肌样，融合后形成峰谷状排列，并表达平滑肌特异性蛋白标志物α－平滑肌肌动蛋白，诱导分化率为（45.6±3.5）%，与阴性对照组相比差异具有显著性意义（P < 0.05）。 结论：采用此方法成功诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞。     

生物衍生骨支架材料制备及在体内的组织相容性***☆

背景：理想的支架材料必须对机体无毒性，无免疫排斥反应，并能适 时地降解，具有良好的生物相容性，生物衍生骨支架材料能否长期存留体内并发挥功能值得研究。 目的：观察生物衍生骨支架材料植入鼠体内后机体局部组织生物相容性及对免疫功能的影响。 设计：随机对照动物实验。 单位：吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室。 材料：实验于2006-03/2006-07在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成，选用18只雄性BALB/C小鼠，体质量（202）g，雌雄各半；1只昆明小鼠，体质量20 g；1只雌性家兔，体质量2.5 kg，以上实验动物均由吉林大学基础医院实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。猪松质骨（髂骨）为市售。实验用IMDM 培养基为美国Hycolone公司产品，FBS购自美国GIBCO公司，四甲基偶氮唑盐及ConA均为美国Sigma公司产品。 方法：采用猪髂骨制备生物衍生骨支架材料。①采用随机抽签法将BALB/C小鼠分成支架材料植入组、异种骨植入组及对照组，每组6只。支架植入组将支架植入到BALB/C小鼠的下肢肌肉内，异种骨植入组将昆明鼠骨植入到BALB/C小鼠下肢肌肉内，对照组仅将局部肌肉损伤。②术后21 d取材料植入部位及周围组织，大体及苏木精-伊红染色法进行观察材料与组织相容性；采用刀豆蛋白A诱导各组脾淋巴细胞转化，酶联免疫检测仪在λ570 nm波段检测并记录淋巴细胞刺激指数。以补体依赖性细胞毒实验评估各组小鼠免疫功能，即采用酶联免疫检测仪在λ570 nm波段检测并记录各组吸光度值，计算细胞杀伤率。 主要检测指标：①植入物周围组织相容性。②刀豆蛋白A诱导后淋巴细胞刺激指数。③补体依赖性细胞毒实验各组细胞杀伤率。 结果：18只BALB/C小鼠均进入结果分析。①植入物周围组织相容性：支架材料植入组植入21 d后，支架材料组肉眼可见，埋植物周围软组织均无明显充血、变性、坏死、化脓及积液等表现，大量纤维结缔组织长入材料的孔隙之中，包裹并形成纤维囊。苏木精-伊红染色结果显示埋植物周围未见大量中性粒细胞及多核巨细胞等炎细胞浸润。材料周围有大量纤维结缔组织增生，材料被纤维囊包裹。同时有部分材料已经开始降解，材料降解后的空间有纤维结缔组织增生。异种骨组肉眼见肌肉剖面有坏死组织，苏木精-伊红染色结果显示埋植物周围有大量的中性粒细胞和巨噬细胞浸润，并可见坏死组织。②淋巴细胞刺激指数：异种骨植入组淋巴细胞刺激指数高于对照组，差异有显著性意义（P < 0.05），支架材料组与对照组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。③细胞杀伤率: 异种骨植入组的细胞杀伤率明显高于对照组，差异有显著性意义（P < 0.05），支架材料组的细胞杀伤率与对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论：本实验获得的生物衍生骨支架材料引起的免疫反应较弱，无明显细胞毒性，不产生明显的炎症反应，具有良好的生物相容性和生物安全性。     

藻酸钙凝胶复合骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨极量缺损****☆◆

背景：课题组前期已经发现藻酸盐凝胶/骨髓间充质干细胞复合物能在体内形成软骨，并能稳定分泌Ⅱ型胶原。 目的：在前期工作的基础上，观察藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物修复大鼠颅骨极量缺损的效果。 设计、时间及地点：配对对照观察实验，2004-01/2008-02在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：将1.2%藻酸钠与骨髓间充质干细胞混匀后滴入氯化钙溶液，制备藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合体。 方法：SD大鼠24只，在其颅骨两侧各做一直径5 mm的极量全层骨缺损，随机植入藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合体（实验侧）及无细胞的藻酸钙凝胶（对照侧）。在术后4周和8周分别处死12只动物，取缺损植入处进行检测。 主要观察指标：X射线检测成骨情况，苏木精-伊红染色及改良Masson三色染色观察组织学变化，透射电镜观察超微结构，同时进行Ⅰ型 和 Ⅲ型胶原免疫组织化学检测。 结果：24只SD大鼠均进入结果分析。X射线检测发现，与对照侧相比，实验侧缺损的边缘有明显钙化密度增高表现。组织学、免疫组织化学检测均显示藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物中形成的组织呈现出交织状骨组织学特征，新骨量多而且结构酷似成熟骨。 结论：藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物能用于修复颅骨极量骨缺损。     

胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原细胞相容性比较★

背景：因心脏结构高度复杂、心肌组织有很高的机械顺应性，心肌组织工程对材料的要求高。以往研究表明Ⅰ型胶原和胶原海绵材料均适宜心肌细胞生长及分化。 目的：拟进一步对比观察胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原与骨髓间充质干细胞的相容性, 为心肌组织工程选择更理想的载体材料。 设计、时间及地点：在解放军第四军医大学西京医院心血管内科实验室2007-03/10完成对比观察设计的实验。 材料：胶原海绵由上海其胜制剂有限公司提供；温敏型Ⅰ型胶原由第四军医大学组织工程中心提供。 方法：将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分别复合于胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原材料，共同培养7 d，分别于培养第1，3，5 和7天取材。 主要观察指标：扫描电镜和苏木精-伊红染色观察骨髓间充质干细胞细胞形态及附着情况；MTT检测骨髓间充质干细胞细胞增殖情况。 结果: ①扫描电镜检测显示温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞黏附优于胶原海绵材料，细胞在Ⅰ型胶原材料中生长连接成片，表面有大量分泌颗粒。②MTT检测表明在培养第1，3，5，7天温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞活性（吸光度值）及细胞分裂增殖速度均高于胶原海绵材料（P < 0.01）。 结论:温敏型Ⅰ型胶原体外与骨髓间充质干细胞的相容性优于胶原海绵。