采用原位末端标记法检测人植入前胚胎中的凋亡征象

目的建立原位末端标记法（TdT-mediated nick end labeling TUNEL）检测人植入前胚胎凋亡征象的方法,阐明凋亡与人类植入前胚胎发育的关系。方法取试管婴儿助孕技术后异常受精的三原核（3PN）胚胎,于2-10细胞期进行固定,采用TUNEL法检测3PN胚胎中的凋亡征象。结果在发育正常3PN胚胎中,未检测到凋亡征象;在20%有碎片的3PN胚胎中检测到TUNEL阳性信号。结论采用TUNEL法可以有效检测人植入前胚胎中的凋亡征象,植入前胚胎中的细胞碎片可能与凋亡有关。     

凋亡调节基因bcl-2及p53在早期胚胎中的表达

目的 探讨两种重要的细胞凋亡调控基因bcl-2及p53在着床前小鼠胚胎中的表达及其其对着床前胚胎发育的作用。方法 建立超排卵小鼠早孕的模型，获取着床前胚胎，采用免疫组化LSAB法、检测bcl-2及p53蛋白。结果在小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑葚胚中，均检测到bcl-2和p53蛋白。结论 bcl-2和p53凋亡调控基因在小鼠着床前胚胎的表达可能与细胞碎片形成有关，对于维护胚胎正常发育，促进发育异常的胚胎细胞发生凋亡，从而提高胚胎质量有重要作用。体内增殖与凋亡处于一个动态平衡，共同调节胚胎发育。     

人植入前胚胎细胞超薄电镜切片制作

目的改进人植入前胚胎细胞超薄切片的制备方法,观察不同时期人早期胚胎细胞超微结构的变化。方法选取我院生殖中心试管婴儿助孕技术后异常受精的3原核胚胎,于2~8细胞期进行固定,改进透射电镜的常规操作方法,使用3%~4%琼脂进行预包埋,制成超薄切片后在镜下观察植入前胚胎细胞凋亡的超微结构。结果使用本方法可以对少量胚胎进行超薄切片的制作。结论使用3%~4%琼脂预包埋的方法可以成功的制作人植入前胚胎细胞的超薄电镜切片。     

不同发育阶段人胚胎脊髓中细胞凋亡的表达及变化

目的:研究人胚胎脊髓生长发育过程中细胞凋亡的变化趋势.方法:采用TUNEL法标记检测从3周至8个月不同胚胎龄段脊髓细胞凋亡的变化规律.结果:3周在神经管上皮即可见到密集的凋亡细胞,5、6周基板、翼板形成后即可在其内见到凋亡细胞,而边缘层内的凋亡细胞出现时间较其他部位晚,9周才可见到,中央管神经上皮的凋亡细胞高峰出现时间较早,5～6周达高峰,3个月后趋于稳定,而腹角内凋亡细胞高峰出现时间在6周,背角内凋亡细胞高峰出现时间为11周,其后随着脊髓的发育,凋亡逐渐减少.结论:脊髓不同部位细胞凋亡出现时间和达到高峰的时间均不同,提示在脊髓的不同部位凋亡并不同步.     

GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表达及其作用

目的 通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因 (GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达及其与胚胎质量之间的相关性,探讨GRIM-19在小鼠植入前胚胎发育中的作用。方法 采用实时定量PCR,检测小鼠植入前胚胎（2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚）中GRIM-19 mRNA水平 (n =16);将小鼠8 细胞期胚胎按卵裂球大小、形态、透明带、胞质碎片分为优胚组和非优胚组,分别检测两组胚胎GRIM-19 mRNA水平,并分析其相关性 (n =13);制作假孕鼠（23只）,并随机分为A组（12只）和B组（11只）,采用移植器将优质和非优质8-细胞期胚胎移入假孕鼠的子宫内,观察两组雌鼠妊娠率及产仔率。结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势。优质8-细胞胚胎的GRIM-19 mRNA水平明显高于非优胚组（P <0.05）。两组8-细胞胚胎移植后,A组雌鼠妊娠率及产仔率显著高于B组雌鼠（P<0.05）。 结论 小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而变化,且与胚胎质量密切相关。     

抗BrdU单克隆抗体在凋亡细胞检测中的应用研究

目的 探讨将自制的抗BrdU单克隆抗体（mAb）用于TUNEL法检测凋亡细胞的可能性。方法 分别用TUNEL免疫荧光法和免疫组化技术，检测地塞米松诱导的凋亡胸腺细胞和射线照射的大鼠皮肤组织中的凋亡细胞。结果 用TUNEL免疫荧光法和TUNEL免疫且化法法检测发现，凋亡细胞的细胞核分别呈明显的荧光或酶底物着色，而非凋亡细胞不显示荧光或无酶底物着色。结论 该抗BrdU mAb用于TUNEL法，能够检测单个细胞标本或组织切片中的凋亡细胞，为国内开展凋亡细胞的检测，提供了一种新的方法。     

粉防己碱诱导人红白血病细胞凋亡的研究

目的　探讨粉防己碱诱导人红白血病细胞 (K56 2 )凋亡的作用。　方法　采用光镜、电镜、免疫荧光观察K56 2 细胞形态的改变 ,以流式细胞仪分析细胞周期 ,以ABC法检测细胞中Bcl 2和p5 3蛋白的改变 ,以TUNEL法检测细胞凋亡。　结果　K56 2 细胞经粉防己碱诱导 4 8h后 ,出现细胞凋亡早期形态学改变 ;流式细胞仪显示细胞DNA合成受到抑制 ;ABC法检测出细胞中Bcl 2水平降低和p5 3水平升高 ;TUNEL法原位检测揭示有DNA断裂。结论　粉防己碱可抑制K56 2 细胞的生长 ,其作用与浓度相关 ,最终可导致细胞凋亡     

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG_2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究。方法构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG_2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率。结果PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48h达到最高凋亡效应。结论PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础。     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

FAK反义寡核苷酸促进人肺动脉平滑肌细胞凋亡

目的： 了解黏着斑激酶(focal adhesion kinase FAK)是否参与人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)凋亡。 方法： 纤黏连蛋白(FN 40 mg/L)刺激下培养的HPASMCs被用来进行反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides， ASODNs）转染以做进一步实验。采用免疫印迹方法测定FAK蛋白质及凋亡蛋白半光氨酸蛋白酶－3（caspase-3）的表达, TUNEL法检测细胞凋亡。 结果： 免疫印迹方法测定结果表明,应用FAKASODNs转染后HPASMCs中FAK的表达明显低于转染前(P<0.01); caspase-3在应用FAKASODNs转染后高于转染前(P<0.05), TUNEL法检测结果表明FAKASODNs转染后细胞凋亡增加。 结论： 本实验结果表明FAKASODNs抑制细胞增生,促进细胞凋亡。其机制很可能是经caspase-3信号通路促进细胞凋亡。     

X射线诱导非小细胞肺癌Axin表达增加并促进A549和BE1细胞系凋亡

目的研究在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,Axin(Axis inhibitor)与细胞凋亡的关系以及X射线能否上调NSCLC组织中Axin表达,并促进NSCLC细胞凋亡。方法用免疫组织化学和TUNEL(TdT-mediated dUTP-X射nick end labeling)法检测95例NSCLC组织内Axin的表达及凋亡情况。将新鲜的NSCLC组织及培养的细胞系(A549和BE1)用X射线照射后,用免疫印迹和RT-PCR方法检测组织中Axin、凋亡蛋白caspase-3表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果在hNSCLC组织内,可见少量凋亡细胞和Axin阳性细胞,凋亡与Axin的表达呈正相关。X射线照射后,部分病例的hNSCLC组织内Axin表达明显上调并促进A549和BE1细胞系凋亡。结论 X射线能诱导NSCLC组织Axin表达上调并促进A549和BE1细胞凋亡。     

Programmed cell death and human embryo fragmentation

The quality of embryos produced by in-vitro fertilization (IVF)is variable. Many embryos contain unequal sized blastomeresand multiple cellular fragments. Embryos with excessive fragmentationhave limited developmental potential both in vitro and in vivo.Histologically, some blastomeres of fragmented embryos resemblecells undergoing apoptosis as a result of programmed cell death(PCD). The objective of the present study was to determine ifthe morphological features of apoptosis are observed in fragmentedhuman preimplantation embryos, supporting the possible involvementof PCD in early human embryo arrest and demise. Using combinednuclear and terminal transferase-mediated DNA end labelling(TUNEL) on arrested, fragmented human embryos, we were ableto detect extensive condensation and degradation of chromatin,compatible with apoptosis. Electron microscopy confirmed thetypical morphological features of apoptosis. No such abnormalitieswere observed in spare embryos with regular sized blastomereswithout fragmentation. The high incidence of condensed chromatin,TUNEL detection of degraded DNA, cell corpses and apoptoticbodies in fragmented human embryos strongly suggest that PCDis triggered in human embryos at a stage prior to blastocystformation. At such early stages, occurrence of apoptosis seemedto be detrimental, leading to preimplantation embryo death. apoptosis/fragmentation/preimplantation embryo/programmed cell death     

颞叶癫痫病灶内bax、fas、caspase-3蛋白的表达

目的探讨细胞凋亡调控基因bax、fas、caspase-3在颢叶癫痫患者病灶内的表达及意义。方法应用免疫组化S-P法检测24例颞叶癫痫患者手术切除病灶内凋亡相关基因bax、fas、caspase-3的表达,同时采用光镜、电镜及原位末端标记（TUNEL）方法检测神经细胞凋亡的情况。结果bax蛋白在癫痫组与对照组中均轻微表达,两者间差异无显著性（P〉0.05）;fas蛋白在对照组中无表达,在癫痫组表达明显增强（P〈0．001）;caspase-3在对照组中有轻微表达,在癫痫组表达明显增强（P〈0．01）。光镜检查及TUNEL染色均未发现凋亡的神经细胞,但电镜检查的8例标本中有3例发现少量早期凋亡征象的神经元。结论癫痫患者脑内存在神经元凋亡现象。fas、caspase-3基因在这一过程中可能发挥了重要作用。     

Age and gender effects on apoptosis in the human coronary arterial wall

The relationship between aging and apoptosis remains unclear. We wondered whether apoptosis could be enhanced in arterial aging in the absence of overt or advanced arterial disease. Apoptosis-related proteins were investigated using three methods: TdT-mediated dUTP digoxigenin nick end labeling (TUNEL) technique, active cysteine-dependant aspartate specific proteases (caspase)-3 and poly ADP-ribose polymerase (PARP) in coronary arteries of human subjects ranging from 25 to 92 years. We found no significant correlation between age and the apoptotic index using the three methods. The percentage of active caspase-3 positive cells was found to be significantly higher in men than in women (9.11 +/- 12.3 cells/mm(2) versus 2.01 +/- 4.55 cells/mm(2), respectively, p = 0.017). These sex-related differences did not reach statistical significance using TUNEL (9.93 +/- 17 and 2.61 +/- 4.58 cells/mm(2), p = 0.32) and PARP methods (3.42 +/- 7.74 and 0.86 +/- 0.95 cells/mm(2), p < 0.49). This is the first report of detection of apoptotic cells in the human arterial wall in adult subjects free from arterial diseases. Apoptosis is an attractive hypothesis to account for organ aging, but our study suggests that apoptosis is not a key factor in aging of the arterial wall.     

The multidrug resistance and apoptosis evaluation in acute myeloid leukemia cells after the in vitro doxorubicin treatment

The apoptosis failure in cytostatic treatment of haemoblastosis is one of the means of chemoresistance. We were interested in the relationship of the after-doxorubicin-treatment-AML cells apoptosis and the immunophenotype, selected clinical and laboratory parameters, and also the P-gp, MRP, LRP, Bcl-2, Bax proteins expression. All analysis were evaluated with the flow cytometry method. To detect apoptotic cells in the sample, we used three methods: annexin test, TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling) test, and caspase 8 detection. After the cell cultivation the statisticaly important increase of apoptotic cells in the culture was apparent. The relation between the AML blast in vitro reaction and some clinical parameters such as the age of patient, white blood cell count, and blast percentage was also observed.     

γ辐射诱发的人AHH-1 T淋巴细胞凋亡及其调控机制

目的：研究电离辐射诱发正常人AHH-1 T淋巴母细胞凋亡的特点及其调控机制，为辐射免疫损伤的防治提供实验依据。方法：用TUNEL、麦格-姬姆萨(MGG)法、MTT比色法及碱磷酶免疫组织化学染色法。分别检测T细胞凋亡、细胞活存以及Bax、Bcl-XL和caspase-3重要凋亡相关蛋白的表达及规律。结果：①在一定照射剂量范围内随照射剂量的增加，AHH-1 T细胞凋亡率持续升高，而细胞活的活存率则急剧下降，两者均呈现明显的剂量效应关系。②促凋亡蛋白Bax的表达随照射剂量的增加明显增强，而凋亡抑制蛋白Bcl-XL则呈持续下降的趋势。③活化的凋亡执行蛋白caspase-3的活性随照射剂量的增加显著升高，与凋亡率呈现明显的相应关系。结论：AHH-1 T细胞的大量凋亡，可能是辐射导致淋巴细胞急剧减少、机体免疫功能降低的重要原因；Bax、Bcl-XL和caspase-3蛋白在辐射诱发的T细胞凋亡调控中具有重要作用。     

Effect of hydrogen peroxide on the metabolism of articular chondrocytes

OBJECTIVE: To examine the effect of hydrogen peroxide on chondrocyte metabolism. MATERIALS AND METHODS: Bovine articular chondrocytes were used. Proteoglycan (PG) synthesis was measured with [35S] sulfate incorporation. For detection of apoptosis, the TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and annexin V assay were used. Extracellular-regulated protein kinase (ERK) activity was measured using a mitogen-activated protein kinase assay system. RESULTS: Addition of hydrogen peroxide resulted in the inhibition of PG synthesis, apoptosis, and enhanced ERK activity. CONCLUSION: Hydrogen peroxide plays an important role in regulating the metabolism of chondrocytes.     

胃癌及其癌前病变中细胞凋亡及其调控基因的表达

目的:通过观察胃癌及其癌前病变中细胞凋亡及其调控基因p53、bcl-2、c-myc的表达,探讨其在胃癌恶性转化进程中的作用。方法:利用DNA末端标记技术(TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL法)和免疫组织化学(streptavidin/peroxidase,S-P法),原位观察了46例胃癌、20例癌前病变、24例正常粘膜中的凋亡细胞和p53、bcl-2、c-myc的表达。结果:癌前病变和胃癌中凋亡指数显著高于正常粘膜(P＜0.01),癌前病变组高于胃癌组(P＜0.01)。p53、bcl-2、c-myc蛋白在胃癌中阳性率分别为60.9%、67.4%、73.2%,均高于正常粘膜组(P＜0.01);在癌前病变中3种蛋白阳性表达率分别为40%、95%、58.8%(P＜0.01)。胃癌中p53、bcl-2蛋白阳性细胞凋亡指数分别低于阴性组(P＜0.05),c-myc蛋白阳性组细胞凋亡指数高于阴性组(P＜0.01)。结论:细胞凋亡调控异常在胃癌发生中可能起重要作用。p53、bcl-2蛋白分别抑制细胞凋亡,c-myc蛋白在胃癌中促进细胞凋亡。     

饮酒与男性不育的关系研究

目的探讨长期高浓度过量饮酒者精液中一氧化氮（NO）含量其精子质量和生精细胞凋亡与不育的关系。方法随机将146例精液分为5组,采用硝酸还原酶法特异地将NO代谢产物硝酸盐（NO3^-）测还原成亚硝酸盐（NO2^-）总量代表NO水平。用脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）介导的缺口末端标记（TUNEL）法和双目光学显微镜,分别检测和观察生精细胞的凋亡率及形态结构。用SQA-V全自动精子质量分析仪,测定精子质量。结果未饮酒生育组精液中NO的含量为（54.81±11.45）μmol/L,生精细胞的凋亡率（4.52±1.23）%,精子质量活率（80.24±0.17）%、活力a＋b（78.32±0.12）%、畸形率（5.30±0.13）%,与长期高浓度过量饮酒各组结果相比,均呈显著性差异（P〈0.01,见表2）。长期高浓度过量饮酒各组NO的含量和生精细胞的凋亡率呈显著的正相关（r=0.93）。凋亡的生精细胞核染色质浓缩于核周形成新月形,核裂解形成凋亡小体。结论长期高浓度过量饮酒者精液中NO的含量和生精细胞的凋亡率均升高,精子质量低下。提示长期高浓度过量饮酒可致机体NO过度产生而促使生精细胞凋亡致男性不育的因素之一。