树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

液质联用分析肝癌细胞HLA Ⅰ类分子递呈的抗原肽

0 引言HLA-抗原肽是抗原经过抗原递呈细胞(APC)加工后,由HLA分子递呈给T细胞抗原受体(TCR)的短肽. 寻找能够为T细胞所识别的HLA结合肽对于肿瘤免疫学研究及肿瘤有效防治具有重要的理论意义和应用价值,许多国家都在致力于这一领域的研究. 细胞HLA-抗原肽含量很少,分子量很小,难于纯化和测序,是免疫学研究的一个难点. 我们应用肝癌细胞膜酸洗技术及高效液相色谱与质谱联用技术首次分析和鉴定了一条为HLA-A2递呈的肝癌抗原肽.     

肝癌细胞实验室大量培养的方法及其质控

目的:探讨以提取肝癌抗原肽为目的的肝癌细胞实验室大量培养方法及其质量控制。方法:先利用普通培养瓶在CO_2孵箱中进行少量培养,再接种到10L转瓶进行旋转培养;FCM检测MHC-Ⅰ类抗原表达。结果:细胞数增加1～9倍,不仅保持了MHC-Ⅰ类抗原的表达量,而且,培养细胞质量高、好。结论:建立了用于制备肝癌抗原肽的肝癌细胞实验室大量培养方法。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞杀伤活性和TCR VβT细胞增殖的研究

【摘　要】　目的　了解急性髓系白血病KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞的特异性细胞毒作用和T细胞受体(TCR) Vβ谱系表达和克隆性情况。方法　分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,建立TCR Vβ谱基因扫描技术,并用其检测5例健康个体T细胞克隆表型。采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养方法,以照射后的KG1a细胞作为刺激原体外诱导外周血单个核细胞增殖,应用LDH释放法检测不同效靶比时诱导前后T细胞杀伤KG1a细胞的活性,同时利用基因扫描技术分析诱导后TCR Vβ亚家族的克隆性增殖特点。结果　基因扫描显示5例健康人全部TCR Vβ谱型均呈高斯(钟型)分布,各亚家族表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布。KG1a细胞可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,并具有特异性识别和杀伤KG1a细胞的功能。结论　KG1a细胞在体外可诱导T细胞呈克隆性增殖,此优势增殖的克隆性T细胞具有特异性细胞毒作用,对KG1a细胞具有选择性杀伤作用。     

人血清反应因子基因的原核表达及鸡卵黄多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达人血清反应因子(serum response factor,SRF)基因,制备鸡卵黄抗SRF抗体并鉴定其特性.方法 构建SRF表达载体PGEX-T-2-SRF,并在大肠杆菌中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经谷胱甘肽-S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行鉴定.用纯化的SRF免疫海蓝白母鸡,制备鸡抗SRF抗体.抗体的效价及特异性用蛋白质印迹技术进行测定和分析,免疫荧光鉴定其在心肌细胞中的定位.结果 构建的重组质粒PGEX-4T-2-SRF在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清液中,纯化的SRF经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的SRF免疫制备了鸡抗SRF抗体.蛋白质印迹技术结果表明,该抗体可与原核表达的SRF特异性结合,抗体效价为1:5000.免疫荧光证实该抗体可以和心肌细胞的细胞核特异性结合.结论 在原核细胞中表达了SRF制备的鸡抗SRF的抗体对SRF能进行特异性结合.     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

利用SELDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术建立肺腺癌诊断模型

目的:寻找肺腺癌患者血浆(清)蛋白特异性生物标志物,用最佳的标志蛋白组合建立肺腺癌诊断模型,并探讨其用于肺腺癌筛查的可行性.方法:应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术及CM10芯片,检测45例肺腺癌患者和40例正常人血清蛋白质指纹图谱,用Biomark Wizrd和Biomark Patterns Software软件对结果进行分析,建立肺腺癌诊断模型:双盲法分析另外19例肺腺癌和20例正常人血清的SELDI质谱数据,验证该模型诊断肺腺癌的准确度.结果:肺腺癌患者和正常人血清蛋白质指纹图谱间有31个差异蛋白(P<0.05),其中以分子量为11.66 kD的蛋白在两组血清中的差异最为显著(P<10-7),该蛋白对诊断肺腺癌有很强的敏感性和特异性;软件自动筛选出分子量为11.66 kD的标志蛋白为主根结点,联合3882.9、4673.2、3158.2和2047.2等4个标志蛋白建立了最佳的肺腺癌诊断模型,对肺腺癌诊断(盲法)的敏感性为84.2%(16/19),特异性为90.0%(18/20).结论:SELDI-TOF-MS技术建立的肺腺癌血清检测法,快速、简单、特异和敏感,为肺腺癌诊断和筛查提供了一个可行的途径和方法.     

伴有偏头痛的卵圆孔未闭封堵患者的疗效研究

目的:探讨经皮卵圆孔未闭(PFO)封堵的可行性,为开展此项工作提供理论基础。方法:采用自身对照,收集患者术前术后的HIT-6头痛评分量表得分、手术前后的超声心动图、TCD发泡实验结果、血常规中血小板含量。采集患者术前1h内行Valsalva动作或咳嗽后的股动脉及股静脉血样,术后1d股动静脉血样。并对术后患者规范随访至少1年。结果:动脉血中五羟色胺(5-HT)含量术后较术前明显降低(t=4.877,P0.05),而静脉血中5-HT含量术后与术前比较无明显差异(t=0.063,P0.1)。患者HIT-6得分术后与术前对比,术后偏头痛对生活的影响程度明显降低(t=10.511,P0.05)。TCD发泡实验结果与HIT-6评分资料分级进行Spearman秩相关分析结果显示:一致性分析结果:χ~2=44.69,P=0.020.05,相关系数r=0.74,P=0.000.05,表明栓子信号数量越多,患者头痛越严重。结论:对于存在PFO的严重偏头痛患者而言,行经皮PFO封堵手术治疗能减轻偏头痛的影响。     

人类GAD67基因转染骨髓基质源性神经干细胞及初步检测

目的利用转基因技术将人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因转染骨髓基质源性神经干细胞仍MSCs-D-NSCs），获得GAD67修饰的成体专能干细胞。方法以PCR、双酶切及测序鉴定pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3.1-GAD67重组子；利用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs并促其向NSCs方向分化，将编码人类GAD67基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3．1-GAD67分别转染BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下观察并用流式细胞仪检测转染效率。结果pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD6，均可扩增出约1800bp目的条带，经双酶切和基因测序证实。荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光细胞，两种载体转染效率分别为39.3％和40.5％。结论pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67真核表达载体重组正确，利用脂质体介导人类GAD6，基因能有效转染BMSCs-D-NSCs，为进一步观察其GAD67基因和蛋白的表达提供了前提条件。