分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的 筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株.方法 采用PCR反应从pORF-h IL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12.将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12).结果 成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变.rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的 片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌.rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带.结论 分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功.     

卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素(IL)-2的重组卡介苗(BCG)。方法 分别以BCG和IL-2cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和399bp的IL-2基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌-BCG穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将IL-2基因克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIL-2。结果 质粒pMSIL-2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和IL-2正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIL-2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL-2，该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的:构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗(Bacille calmette-guerin.BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法:以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果:电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带.结论:成功构建含pBM12的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

小鼠单链自细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的：构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗（Bacille calmette—guerin,BCG）,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法：以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT—PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果：电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带。以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT—PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带。结论：成功构建含pBM12的重组BCG。该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。     

Ag85a-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗.方法 通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85a的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗.结果 通过PCR扩增获得约800 bp的ag85a基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明ag85a基因正确插入到pYUB295质粒中.将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好.pYUB295-ag85a重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明:ag85a-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85a蛋白在卡介苗中分泌表达.结论 成功构建了ag85a-卡介苗重组疫苗.     

重组人白介素2卡介苗的构建及表达

采用聚合酶链反应及基因工程技术,克隆卡介苗（ＢＣＧ）的主要分泌抗原Ａｇ８５Ｂ基因的５’端第９４～２１１的核苷酸的信号肽序列和构建重组人ＩＬ－２穿梭表达质粒,并用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）鉴定外源基因在ＢＣＧ中的表达。结果表明,构建的ＢＣＧ重组体能表达和分泌人ＩＬ－２。此将试用于临床治疗膀胱癌病人。     

卡介苗对支气管哮喘患者肺功能及外周血IL-4、IF Nγ及IL-12表达水平的影响

目的：探讨卡介苗在调节Th细胞的免疫失衡、改善哮喘发作时气道炎症反应的可能机制。方法随机将208名PPD试验阴性的哮喘患者分为干预组和常规治疗组,观察6个月,于治疗前后评估两组肺功能及血清IL-4、IFN-γ、IL-12水平的变化。结果两组治疗后肺功能均较治疗前有改善（P＜0．05）,治疗后干预组较常规治疗组肺功能改善明显,差异有显著性（P＜0．05）;治疗后干预组较常规治疗组 IFN-γ、IL-12升高明显,IL-4下降更明显,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论卡介苗通过调节哮喘患者Thl/Th2比例失衡改善肺功能。     

基因变构IL-2重组克隆的构建

①目的 构建基因变构IL-2（88ArgIL-2)的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后，获得cDNA文库，并以此为模板，经套式PCR扩增得IL-2的基因编码序列。测序确认正确后，设计含有突变位点的引物，经pCR定点诱变技术获得变构IL-2克隆并进行序列确定。③结果 IL-2基因定点诱变成功，并获得了基因变构IL-2重组克隆。④结论 IL-2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2奠定了基础。     

IL-35在免疫相关疾病中的研究进展

白细胞介素-35(IL-35)是白细胞介素-12(IL-12)家族的新成员,由Collison等[1]在2007年最先发现并确认。IL-12家族共有4个成员,分别为:IL-12、IL-23、IL-27、IL-35。这4种细胞因子均为异质二聚体,每1个异质二聚体细胞因子均由1个折叠螺旋束样细胞因子(four helix bundle cytokines)亚单位(IL-12p35、IL-23p19、IL-27p28、IL-35p35)和1个可溶型细胞因子受体样亚单位(p40和EBl3)组成(图1)[2]。1 IL-35及其家族成员受体IL-12受体为IL-12Rβ1/IL-12Rβ2二聚体,2个     

PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1（PstS1）的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果：用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37R_V基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实：PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论：成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。     

重组IL-35-BCG新生儿期接种对实验性哮喘模型Tregs及Th17的影响

目的 建立重组卡介苗(recombinant Bacillus Calmette-Guérin,rBCG)新生期接种的小鼠哮喘模型,观察生命早期进一步加强Tregs类免疫反应后,哮喘发作阶段气道炎症受到的干预作用及其机制。 方法 清洁级BALB/c新生小鼠随机分为3组:IL-35-BCG组、OVA组、对照组,IL-35-BCG组新生期接种后分别在生后第4周和第6周进行OVA致敏,OVA组新生期给予BCG稀释液(不含BCG)接种后分别在生后第4周和第6周进行OVA致敏,除对照组外小鼠哮喘模型均在第7周开始使用OVA激发,连续激发1周,最后一次激发后24 h内,进行相关检测。 结果 IL-35-BCG组与OVA组支气管肺泡灌洗中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等比例都比对照组明显升高,而IL-35-BCG组上述细胞均显著低于OVA组。流式细胞术显示IL-35-BCG组与OVA组肺部Tregs细胞比例均明显高于对照组(均P<0.05),且与OVA组相比,IL-35-BCG新生期接种组哮喘小鼠Tregs细胞比率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-35-BCG组与OVA组肺部Th17细胞比例均明显高于对照组(均P<0.05),但与OVA激发的哮喘组比较,新生期IL-35-BCG接种小鼠激发后Th17细胞比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 新生期接种IL-35-BCG在哮喘期,促进Tregs分化,抑制Th17细胞分化,明显减轻哮喘小鼠模型气道炎症细胞浸润。提示Tregs及Th17细胞在实验性哮喘小鼠发病中起作用,新生期接种IL-35-BCG在生命早期增强Tregs介导的免疫应答,以便诱导Tregs细胞在发生哮喘时发挥抗哮喘作用。      

大肠癌新型CEA疫苗重组杆状病毒的表达与鉴定

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建新型CEA融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒.方法构建含有HPV16L1片段和CEA-PADRE合成片段的表达载体pFastBacl-Ⅴ,转化DH1OBac感受态菌.利用其含有的细菌Tn7转座系统,将该基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中,转染昆虫细胞sf9,获得新型CEA疫苗的重组杆状病毒.结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明目的片断正确克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中;重组杆状病毒感染昆虫细胞后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段.结论利用杆状病毒表达系统,成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗.方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bh及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别.结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)DNA疫苗。方法 扩增全长napA(编码HP-NAP)，将其与克隆载体pBT连接，经测序及同源性分析后，将相应片段亚克隆入真核表达载体pIRES，经双酶切及PCR鉴定。结果 PCR扩增-435bp产物，核苷酸序列测定及BLAST分析表明，所克隆序列与基因库中Hp悉尼株(SS1)napA核苷酸及蛋白质的同源性均为98％。ANTHEPROT软件预测其蛋白质具有良好的疏水性和抗原性。经PCR及双酶切鉴定，证实成功构建携带，napA的重组真核表达质粒plRES-napA。结论 成功构建并鉴定了HP-NAP重组DNA疫苗，为进一步研究其免疫原性及研制口服DNA疫苗奠定了基础。     

携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定

目的构建人白细胞介素18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。方法以质粒pJWIL—18为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得IL-18基因片段，酶切后克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13IL—18。鉴定正确后，将pCA13 IL—18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9-12天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的DNA。进行PCR鉴定。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果酶切分析、序列测定、PCR验证表明，IL-18基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。结论成功构建了表达人IL-18基因的复制缺陷性腺病毒载体。     

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫1330-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M．s载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2，电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中，潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子，温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体，SDS—PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表迭蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗，为弓形虫病的防治提供了-种新方法。     

人MxA基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。     

Construction and identification of recombinant attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori urease subunit B

Objective To construct a recombinant live attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori urease subunit B (ureB).Methods ureB gene was amplified by PCR and cloned into a prokaryotic expression plasmid pTrc99a, and the identified recombinant plasmid was then used to transform an attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain SL3261. The ureB expressed in the recombinant vaccine strain was analyzed by SDS-PAGE and optical density scanning. Two and 10 days after recombinant strain intragastric immunization, the C57BL/6 mice were sacrificed, and the spleens and terminal ileums were cultured.Results The ureB gene could be amplified from the recombinant prokaryotic expression plasmid pTrc99A-ureB and the plasmids extracted from transformed SL3261 strain. SDS-PAGE and optical density scanning indicated that ureB was expressed in the recombinant vaccine strain SL3261 (pTrc99A-ureB) as a protein with 66*!kD of molecular weight. Recombinant strain was found in both spleen an terminal ileum of each mouse two and ten days after intragastric immunization.Conclusions A recombinant liver attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori ureB was constructed and identified, and this study will help to develop an oral recombinant live vaccine against Helicobacter pylori infection.     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。