柴胡皂苷A通过Wnt/β-catenin通路改变A549/DDP细胞耐药性

目的 探讨柴胡皂苷A（SSA）逆转人肺癌顺铂（DDP）耐药株A549/DDP的作用及机制。方法 细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测A549和A549/DDP对DDP的耐药性及SSA对A549和A549/DDP细胞活力的影响；流式细胞术检测A549/DDP凋亡率和细胞中活性氧（ROS）的变化；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测C-myc，B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3） mRNA的表达情况；TopFish双荧光素酶报告基因检测β-连环蛋白（β-catenin）的转录活性；蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测A549/DDP细胞中β-catenin蛋白的变化。结果 CCK-8检测结果显示，A549/DDP的耐药性是A549的12.82倍，差异具有统计学意义（P<0.05），SSA能够抑制A549的细胞活力，其半数抑制浓度（IC₅₀）为34.9 μmol·L^-1。SSA抑制 A549/DDP细胞的活力并具有浓度依赖性，在20 μmol·L^-1浓度时，对A549/DDP的抑制率<10%，选择20 μmol·L^-1作为逆转浓度；流式结果显示，与空白组比较，DDP组A549/DDP的凋亡比例明显升高，细胞内活性氧的累积明显增加（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组A549/DDP的凋亡比例明显升高，细胞内活性氧的累积明显增加；与空白组比较，DDP组A549/DDP细胞中C-myc，Bcl-2 mRNA表达明显降低，Caspase-3 mRNA表达明显升高（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组C-myc，Bcl-2 mRNA表达明显降低，Caspase-3 mRNA表达明显升高（P<0.05）；与空白组比较，DDP组β-catenin的转录活性明显降低（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组β-catenin的转录活性明显降低（P<0.05）；与空白组和DDP组比较，SSA+DDP组β-catenin蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 柴胡皂苷A可以提高A549/DDP细胞对DDP的敏感性，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。     

柴胡皂苷D通过抑制EMT和细胞干性抑制人结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D，SSD）对人结直肠癌细胞SW480迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨SSD抑制细胞迁移和侵袭的机制。方法:MTT检测SSD对细胞增殖的影响。划痕实验和Transwell迁移实验研究SSD对细胞迁移能力的影响。Transwell侵袭实验研究SSD对细胞侵袭能力的影响。Western-blot检测SSD对上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）表达的影响。克隆球形成实验研究SSD对细胞干性的影响。结果:在划痕实验和Transwell迁移实验中，SSD显著抑制SW480的迁移能力（P<0.05）。在Transwell侵袭实验中，SSD显著抑制SW480的侵袭能力（P<0.05）。SSD处理后，细胞E-cadherin的表达增高，N-cadherin和Vimentin的表达降低（P<0.05），同时SSD抑制SW480细胞克隆球的形成（P<0.05）。结论:柴胡皂苷D通过抑制EMT和细胞干性抑制人结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭。     

柴胡皂苷D通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480增殖的实验

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D，SSD）对人结直肠癌细胞SW480自噬的影响，并探讨诱导的自噬对细胞增殖的影响。方法:Western-blot检测SSD对自噬相关蛋白LC3A/B和p62表达的影响，LC3翻转实验和GFP-RFP-LC3荧光实验验证自噬流的发生。Western-blot检测3-MA对SSD所诱导自噬的抑制作用，MTT和细胞计数实验研究3-MA抑制自噬后SSD对SW480细胞增殖的影响。结果:SSD能够诱导SW480细胞发生自噬，表现在LC3A/B II及LC3A/B II/I比值的增高、自噬经典底物蛋白p62的减少、LC3翻转试验阳性以及LC3荧光实验中黄色和红色荧光颗粒的增多（P＜0.05）。自噬抑制剂3-MA能够抑制SSD所诱导自噬的发生（P＜0.05），且3-MA抑制自噬后，SSD对SW480的增殖抑制效应减弱（P＜0.05），提示SSD诱导的自噬对细胞的增殖起抑制作用。结论:SSD通过诱导自噬抑制人结直肠癌细胞SW480的增殖。     

多指标正交试验优选鳖血柴胡的炮制工艺

目的: 优选鳖血柴胡的炮制工艺。 方法: 以柴胡皂苷a,c,d及醇溶性浸出物含量的综合评分为指标,通过正交试验考察炮制时间、鳖血用量、炮制温度对鳖血柴胡炮制工艺的影响。采用HPLC测定柴胡皂苷a,c,d的含量,流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0~50 min,25%~90%A;50~55 min,90%A),检测波长210 nm。 结果: 炒制时间对炮制工艺具有显著性影响。最佳炮制工艺为150 ℃炮制10 min,加鳖血量0.05 mL ·g^-1。醇溶性浸出物及柴胡皂苷a,c,d质量分数分别为12.42%,0.85%,0.23%,0.90%。 结论: 优选的炮制工艺合理可靠、重复性好,为规范鳖血柴胡饮片的炮制加工提供参考。     

柴胡皂苷D对人胚肺成纤维细胞增殖的影响及机制探讨

目的观察柴胡皂苷D对人胚肺成纤维细胞增殖的影响,并初步探讨其机制。方法培养人胚肺成纤维细胞,将柴胡皂苷D配置成4个浓度梯度(0、2.5、5.0、10.0μg/ml),分4组分别干预培养,噻唑蓝比色法(MTT)法检测4组细胞在0~96 h内增殖能力的改变,并绘制细胞生长曲线图;流式细胞术检测4组细胞培养至96 h时的增殖周期,并用反转录(RT)-PCR法检测细胞在不同浓度柴胡皂苷D干预培养下转化生长因子(TGF)-β_1mRNA的表达水平。结果根据MTT结果绘制的细胞生长曲线,提示柴胡皂苷D能抑制人胚肺成纤维细胞增殖,且在0~10.0μg/ml浓度范围内成浓度依赖性;流式细胞术检测细胞周期,发现细胞周期能被柴胡皂苷D阻滞在G1期,其中10μg/ml浓度时阻滞作用更为显著;RT-PCR检测4组细胞TGF-β1 mRNA表达,结果表明柴胡皂苷D成浓度依赖性地抑制了细胞分泌TGF-131。结论柴胡皂苷D抑制了人胚肺成纤维细胞增殖,其机制可能与阻滞细胞周期及抑制TGF-β1分泌有关。     

柴胡桂枝干姜汤治疗失眠的功效网络研究

目的运用网络药理学分析方法,明确柴胡桂枝干姜汤治疗失眠的作用机制。方法运用TCMSP、TCMID数据库锁定柴胡桂枝干姜汤7味药的药物靶标,TTD、DrugBank、PubMed数据库查找失眠的疾病靶点,构建"疾病-方剂-靶点"网络,用STRING和Cytoscape分析软件对其关键靶点进行富集分析,明确作用机制。结果柴胡桂枝干姜汤蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络包含靶标640个,失眠的PPI网络包括靶标175个,富集分析得29个关键靶标和其间80条互作关系;GO富集分析及KEGG途径分析结果显示柴胡桂枝干姜汤中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素、碳酸钙、6-姜辣醇、山柰酚、汉黄芩素等171个活性成分主要通过CACNA1C、GABRA1、GABRA2、GABRB3、GABRA3等29个关键靶标及突触信号传导、膜电位的调节、G蛋白偶联受体信号通路等生物过程,神经递质受体活性、离子门控通道活动、GABA-A受体活性等分子功能,质膜、突触等细胞组成作用于神经活性配体-受体相互作用、逆行内源性大麻素信号传导、5-羟色胺能突触等多条作用通路发挥治疗失眠作用。结论柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等171个活性成分是柴胡桂枝干姜汤治疗失眠的药效物质基础,神经活性配体-受体相互作用等通路和CACNA1C等29个靶标构成了其发挥"疏肝健脾、调和阴阳"的功效作用网络,为临床合理运用柴胡桂枝干姜汤治疗失眠提供了网络药理学证据。     

HPLC法测定三岛柴胡不同部位柴胡皂苷a、c、d的含量

目的:建立HPLC法测定三岛柴胡各部位的柴胡皂苷a、c、d的含量。方法:采用Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,流速1.0 mL.min-1,检测波长200 nm,柱温25℃。结果:1年生三岛柴胡中各部位柴胡皂苷a、c、d的含量均比2年生三岛柴胡的含量高。在1年生样品中种子含有的有效成分最多,根次之,茎最少;2年生样品中根含有的有效成分最多,种子次之,茎最少。结论:该方法为三岛柴胡不同药用部位的质量控制提供实验依据,该方法具有简便、快速、准确、重复性较好的特点。     

UPLC法测定小叶黑柴胡的根中柴胡皂苷a、d含量

目的:建立超高效液相色谱法检测小叶黑柴胡的根中柴胡皂苷a、d含量。方法:采用Waters Acquity UPLC系统,使用ACQUITY UPLC BEHTM C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,流速0.6 mL.min-1,检测波长203 nm,柱温30℃。结果:柴胡皂苷a线性范围为0.059～1.180μg(r=0.9998),平均回收率为96.7%(RSD=1.3%,n=6);柴胡皂苷d线性范围为0.112～2.230μg(r=0.9997),平均回收率为98.7%(RSD=1.5%,n=6)。结论:该方法操作简便,结果准确,可用于小叶黑柴胡的质量控制。     

HPLC法测定逍遥颗粒中柴胡皂苷a的含量

目的建立HPLC测定逍遥颗粒中柴胡皂苷a的含量方法。方法采用Lanbo Kromasil C18柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,流速：1.0mL.min-1,检测波长：210nm,柱温：30℃。结果柴胡皂苷a进样量在0.34~3.4μg范围内线性关系良好（r=0.9999）;平均回收率为98.38%,RSD为0.57%（n=6）。结论该法结果准确、灵敏度高、重复性好,可用于逍遥颗粒中柴胡皂苷a的含量测定。