SAMHD1通过调控p27表达抑制肝细胞癌细胞增殖的研究

背景与目的：不育α基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1（sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1）具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用，但其调节肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖的作用及机制尚未见报道。探究SAMHD1调控p27的表达对HCC细胞Huh7的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法：首先通过蛋白质印迹法（Western blot）检测正常肝细胞和不同类型HCC细胞中SAMHD1的表达情况。利用基因修饰技术构建过表达SAMHD1、dNTP酶活性位点突变体（SAMHD1-D207N）和磷酸化位点突变体（SAMHD1-T592E）的重组质粒，然后利用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测过表达SAMHD1及其突变体或siRNA干扰沉默SAMHD1对HCC细胞增殖的影响，采用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡情况。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中分析SAMHD1和p27表达的相关性。结果：HCC细胞中SAMHD1表达上调，过表达SAMHD1、SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E可以抑制Huh7细胞增殖，细胞周期停滞在G ₁ /G ₀ 期；相反，干扰SAMHD1后细胞增殖加快，细胞周期停滞在G ₂ /M期。机制研究表明，SAMHD1上调细胞周期蛋白激酶抑制因子p27的表达。在HCC组织中，p27的表达与SAMHD1表达呈正相关。结论：过表达SAMHD1可以上调p27的表达，导致细胞周期停滞在G ₁ /G ₀ 期，从而抑制HCC细胞增殖，这种抑制作用不依赖于其dNTP酶活性和磷酸化修饰。     

HBx介导SAMHD1降解并通过Akt/p27通路促进肝癌细胞增殖的机制研究

目的 研究HBx蛋白调控SAMHD1降解,促进肝癌细胞增殖的机制.方法 收集肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织,通过Western blot检测肝癌组织与相应癌旁组织中SAMHD1的表达;通过CRISP/Cas9基因技术构建敲除SAMHD1的稳定细胞系,检测SAMHD1敲除后,HBV稳定肝癌细胞系HepAD38细胞增殖和细胞周期的变化,通过Western blot检测相关周期蛋白表达的变化和Akt/p27通路的影响.检测HBx蛋白过表达对SAMHD1转录和蛋白水平的影响,通过放线菌酮和MG132处理,以及免疫共沉淀手段,进一步探索HBx调控SAMHD1蛋白降解的分子机制.结果 ①研究发现SAMHD1在肝癌组织的表达量低于癌旁组织(P＜0.01).②成功构建稳定敲除SAMHD1的肝癌细胞HepAD38,MTT实验表明稳定敲除SAMHD1的细胞组较对照组增殖加快(P＜0.01).流式细胞术结果表明敲除SAMHD1的稳定细胞组与对照组相比细胞周期发生改变,敲除组G2/M期细胞数(28.16±0.36)较对照组(22.52±0.56)升高(P＜0.01).③Westem blot检测表明敲除SAMHD1的稳定细胞系与对照组细胞相比细胞周期蛋白表达量发生了改变,实验组细胞p27蛋白表达水平减弱,p-Akt蛋白表达水平提高.④Huh7.0细胞中过表达HBx后,SAMHD1蛋白表达减弱.⑤免疫共沉淀结果表明HBx与SAMHD1相互结合;放线菌酮及泛素化IP实验表明HBx引起SAMHD1蛋白衰减时间提前,并使SAMHD1的泛素化程度加强.结论 HBx与SAMHD1相互作用,通过调控SAMHD1泛素化修饰降解SAMHD1,从而影响Akt/p27通路调控细胞周期,促进肝癌细胞增殖.