Musashi1基因调控结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的机制研究

背景与目的：Musashi1（Msi1）属于RNA结合蛋白家族中的一员，是RNA转录后表达的关键调控者，其是否参与肿瘤的发生、发展，以及具体分子机制仍不十分清楚。探讨沉默Msi1基因对结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的影响及可能的机制。方法：采用慢病毒载体构建稳定低表达Msi1的细胞株，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）实验检测细胞增殖能力，克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞周期的变化，裸鼠移植瘤模型观察沉默Msi1对裸鼠成瘤的影响。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印记法（Western blot）检测沉默Msi1基因后p27基因的mRNA表达和蛋白水平，双荧光素酶实验验证Msi1基因与目的基因p27 3’-非编码区（3’-untranslated region，3’-UTR）的相互作用。结果：沉默Msi1基因后，HCT116细胞的增殖能力显著下降，克隆集落数明显减少，G ₀ /G ₁ 期细胞增多，S期细胞明显减少，裸鼠移植瘤生长明显受到抑制。沉默Msi1基因后p27 mRNA表达未见明显变化，而p27蛋白水平明显上调，双荧光素酶实验证实Msi1基因能与p27 3’-UTR区域直接结合，抑制其翻译。结论：沉默Msi1基因通过靶向上调p27，导致结肠癌HCT116细胞G ₀ /G ₁ 期阻滞，从而抑制肿瘤细胞体内及体外增殖能力。     

PDTC通过抑制NF-κB及下游通路减轻大鼠急性RIHD

目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)能否通过抑制NF-κB及下游通路减轻大鼠急性RIHD。方法 将21只成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组、单纯照射组和PDTC+照射组3组各7只。单纯照射组及PDTC+照射组大鼠接受心前区局部6 MV X线20 Gy单次照射。PDTC+照射组在照射前30 min腹腔注射PDTC,120 mg/kg,1 次/d,第1—14天。照射后第14天取心脏组织观察病理学变化,通过Masson染色计算心肌CVF,蛋白印迹法及实时荧光定量qPCR分别检测3组大鼠心肌组织的NF-κB家族成员p50、p65、HIF-1α、CTGF、COL-1蛋白及mRNA表达量变化。采用t检验差异。结果 HE染色结果显示PDTC+照射组与单纯照射组比较,大鼠心肌细胞水肿减轻,炎症细胞浸润得到改善,成纤维细胞减少。Masson染色结果显示PDTC干预可减轻照射后大鼠心肌细胞间质胶原沉积,半定量分析结果显示PDTC+照射组大鼠的CVF为(9.99±0.32)%,与单纯照射组的(22.05±0.21)%下降(P<0.05)。蛋白印迹和qPCR结果显示PDTC+照射组大鼠心肌组织p50、p65、HIF-1α蛋白表达及mRNA水平较单纯照射组均明显下降(P均<0.05);CTGF蛋白表达水平及mRNA水平较单纯照射组有下降趋势(P均>0.05);COL-1蛋白表水平达较单纯照射组下降(P<0.05);mRNA水平较单纯照射组有下降趋势(P>0.05)。结论 PDTC可通过抑制NF-κB的激活及其下游HIF-1α的转录减轻大鼠急性RIHD。     

益气除湿活血汤对肥胖大鼠糖、脂代谢的影响

目的:研究中药益气除湿活血汤对肥胖大鼠糖、脂代谢的影响及其分子机制。方法:40只SD大鼠随机分为对照组、肥胖组、肥胖+益气汤组和肥胖+二甲双胍组,每组各10只。以高脂、高糖饲料喂养大鼠12周制备肥胖大鼠模型,对照组大鼠给予基础饲料喂养。肥胖+益气汤组、肥胖+二甲双胍组和肥胖组动物分别给予8周益气除湿活血汤、二甲双胍、生理盐水灌胃处理。测定动物体质量并计算Lee′s指数,取血测定空腹血糖(FBG)及血胆固醇和三酰甘油浓度、胰岛素抵抗指数(IRI)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和脂联素水平。结果:与对照组大鼠相比较,肥胖组大鼠体质量、Lee′s指数、FBG、总胆固醇、三酰甘油和IRI均显著升高(P<0.05,P<0.01),血清脂联素明显降低(P<0.01),TNF-α明显升高(P<0.01)。与肥胖组大鼠相比较,肥胖+二甲双胍组大鼠体质量、Lee′s指数、FBG和IRI明显降低(P<0.05,P<0.01),脂联素水平明显升高(P<0.05);肥胖+益气汤组大鼠体质量、Lee′s指数、FBG、IRI、总胆固醇和三酰甘油明显降低(P<0.05)外,血清TNF-α明显降低,脂联素明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:益气除湿活血汤可改善肥胖大鼠糖、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗,此作用可能通过升高血脂联素、降低TNF-α所实现。     

Musashi1在结肠癌中的表达及对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨Musashi1(Msi1)基因在结肠癌中的表达,分析其对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测Msi1在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达情况。通过慢病毒载体构建稳定低表达Msi1的HCT116细胞株(shMsi1组),同时设置空白对照组和NC组。MTS实验检测增殖,流式细胞术检测凋亡,划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力。Western blotting检测沉默Msi1表达对Wnt和Notch信号通路关键分子的影响。结果结肠癌组织中Msi1表达量为3.36±0.75,明显高于癌旁正常组织的0.69±0.33,差异具有统计学意义(P<0.05)。沉默Msi1表达后,shMsi1组24、48、72 h的细胞增殖率分别为(128.00±3.13)%、(162.70±4.28)%、(191.86±7.72)%,明显低于空白对照组和NC组(P<0.05);shMsi1组48h细胞凋亡率为(8.47±1.04)%,明显高于空白对照组的(4.66±0.75)%和NC组的(4.83±1.07)%,差异具有统计学意义(P<0.05);shMsi1组细胞划痕愈合率为(27.38±9.63)%和侵袭细胞数为51.67±13.50,明显低于空白对照组的(58.12±8.54)%、219.00±24.56和NC组的(60.87±10.08)%、212.33±13.58,差异具有统计学意义(P<0.05)。下调Msi1表达后,shMsi1组Frat1蛋白表达量为0.53±0.10,低于空白对照组的1.00±0.16和NC组的0.94±0.13,而shMsi1组Numb蛋白表达量为1.74±0.09,明显高于空白对照组的1.00±0.17和NC组的0.73±0.09,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Msi1可能通过调控Frat1及Numb表达增强结肠癌HCT116细胞增殖、迁移和侵袭能力,并抑制其凋亡。     

NF-κB及下游通路与大鼠急性期放射性心肌纤维化相关性研究

目的 建立急性放射性心脏损伤大鼠模型,观察急性心肌组织炎症反应和纤维化等病理学表现,探讨NF-κB及其下游通路是否与心肌纤维化相关。方法 成年雄性SD大鼠14只,完全随机法均分为对照组和照射组。照射组采用6 MV X线单次20 Gy经心前区照射构建放射性心脏损伤模型,照射后第14天应用HE染色观察心肌细胞及细胞间质形态学改变;Masson染色观察胶原纤维分布情况,并以CVF作半定量分析指标进行成组t检验。蛋白印记法及qPCR法分别检测大鼠心肌组织NF-κB基团成员p50、p65及其下游通路HIF-1α、CTGF、COL-1蛋白及mRNA表达量变化。结果 大鼠心脏局部照射后第14天,照射组较对照组心肌细胞水肿明显、排列紊乱,部分心肌细胞断裂、心肌细胞核轻度固缩、核染色加深,少量异形细胞核,心肌间质可见大量炎症细胞浸润、成纤维细胞增多。Masson染色显示胶原纤维广泛分布于心肌细胞间质,与对照组相比照射组大鼠心肌胶原明显增多,正常心肌细胞排列紊乱、有被胶原纤维替代的趋势。半定量分析结果显示照射组CVF明显高于对照组(22.05%:3.76%,P=0.003)。蛋白印记法及qPCR法结果显示心肌组织p50、p65、HIF-1α、CTGF、 COL-1蛋白表达及mRNA水平照射组较对照组均明显升高(P均<0.05)。结论 急性放射性心脏损伤病理学表现为心肌细胞水肿、细胞间质大量炎症细胞浸润、成纤维细胞增多、胶原纤维增多。其损伤机制可能与心肌组织NF-κB激活有关,同时放射线可引起其下游通路HIF-1α、CTGF在蛋白和基因水平表达上调,可能在放射性心肌炎症向纤维化发展过程中起到重要作用。