不同途径的乳球菌介导重组IL-12基因抗小鼠黑素瘤的效果

利用自身免疫系统或其组分治疗肿瘤是一种新的治疗手段.白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)是一种具有多种生物学活性的免疫调节因子,它可以促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的活性,能刺激T细胞及NK细胞的增殖,并诱导分泌IFN-γ等多种细胞因子[1],因此在抗肿瘤及抗感染中起重要作用.与其他细胞因子一样,直接应用IL-12会导致全身不良反应甚至危及生命.2003年Huber等[2]发现通过滴鼻给药可以降低IL-12介导的不良反应,此外有研究表明利用质粒、腺病毒或腺病毒转染的间质干细胞靶发送IL-12基因到肿瘤部位表达也能抑制肿瘤生长[3-5],而不致产生严重的不良反应.然而质粒发送存在缺乏组织的特异性和靶向性、转染效率较低且基因表达时间短[6]等缺点,发送重组腺病毒载体易导致转染细胞毒性及死亡、基因表达时间受限、可诱导机体产生免疫反应[7]等,限制了这些方式临床应用的效果.     

携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌抗小鼠宫颈癌移植瘤的疗效和安全性

目的： 评价口服携带HPV16 E7 shRNA 和 IL-12 基因的重组短双歧杆菌在小鼠体内抗宫颈癌移植瘤的效果。方法： 将pMG36e-E7 shRNA、pMG36e-mIL-12D 质粒分别转化短双歧杆菌,经筛选鉴定并扩增获得携带HPV16 E7 shRNA和IL-12 基因的重组短双歧杆菌。通过小鼠皮下宫颈癌细胞移植建立荷瘤小鼠模型。口服重组短双歧杆菌1、7 d后,检测小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织匀浆液或血清在PYG培养基中形成的菌落数量,评价短双歧杆菌的肿瘤靶向性,以小鼠体内肿瘤生长曲线评估重组短双歧杆菌的抗肿瘤效果,通过主要器官切片H-E染色和检测荷瘤小鼠血清相关细胞因子水平评价口服重组短双歧杆菌的安全性。 结果： 成功制备重组短双歧杆菌和宫颈癌 TC-1 细胞移植瘤小鼠。7 d后,移植瘤组织匀浆液和血清的菌落数量证实短双歧杆菌具有靶向体内瘤组织的定殖能力,口服重组短双歧杆菌明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长（ P<0.05或P<0.01）,但联合使用携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组双歧杆菌的肿瘤抑制率与单独使用的并无显著差异,治疗后未见对荷瘤小鼠主要器官的损伤和血清中IL-12及IFN-γ的水平明显变化。 结论： 短双歧杆菌可用作靶向肿瘤的治疗性基因分子递送载体,其对宫颈癌移植瘤的疗效明显且安全可控。     

优化密码子提高草原兔尾鼠ZP3融合蛋白的原核表达

目的:探讨提高草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)卵透明带3(LZP3)基因在原核细胞中表达的水平。方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP3基因上3个稀有的密码子簇,将LZP3基因中7个稀有的密码子更换成大肠杆菌(E.coli)最常用的相应密码子。将获得的LZP3突变基因(LZP3m)插入pGEX4T-1中,构建重组表达载体。以重组体转化E.coliBL21(DE3)菌株进行表达。结果:LZP3m基因的表达量比野生型LZP3基因明显提高。结论:通过密码子优化,能显著提高LZP3基因在原核细胞中的表达水平。     

P38MAPK信号通路在压力调控骨髓间充质干细胞膜片成软骨响应中的作用

目的 研究P38丝裂原激活的蛋白激酶（P38MAPK）信号通路在压力调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片成软骨响应中作用.方法 将含有抗坏血酸培养基构建的兔BMSCs细胞膜片分为空白对照组和加压组（静态液压加载装置给予细胞膜片120 kPa、1 h/d、连续4d的压力刺激）,采用Western blot及real time-PCR检测P38MAPK信号通路的表达,real time-PCR技术检测成软骨基因的表达.结果 兔BMSCs传代后细胞生长状态稳定,呈梭形;成骨诱导后,茜素红染色可观察到矿化结节,碱性磷酸酶活性染色呈阳性,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴;Western blot结果显示,与对照组（0.165 ±0.035）比较,压力刺激下兔BMSCs细胞膜片中P38MAPK蛋白表达量（0.820 ±0.108）显著升高（P＜0.05）,同时real time-PCR结果表明：加压组兔BMSCs细胞膜片中P38MAPK的mRNA表达量（0.651 ±0.105）高于对照组（0.166±0.046） （P ＜0.05）,且成软骨基因（Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ）的mRNA表达量（3.323±0.729、0.901±0.162、1.151±0.105）也明显高于对照组（0.541±0.121、0.335±0.094、0.466±0.158）（P＜0.05）.结论 P38MAPK信号通路在压力调控BMSCs膜片成软骨响应中起正调节作用.     

NF-κB在压力调控BMSCs/PRF修复兔髁突软骨缺损中的作用研究

目的:探讨NF-κB信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜结构修复兔髁突软骨缺损中的作用。方法:取3~4月龄雄性新西兰兔30只,分离、培养骨髓间充质干细胞并制备成细胞膜片,抽取自体兔动脉血制备PRF,将二者复合制备BMSCs/PRF双膜结构。在所有实验动物双侧髁突作直径3 mm的缺损,制备髁突软骨缺损模型;将实验动物随机分为5组(n=6),A组:即空白对照组,缺损处不充填;B组:双膜结构充填缺损;C组:压力预调双膜结构后充填缺损;D组:NF-κB抑制剂(PDTC)预处理双膜结构后充填缺损;E组:压力预调加抑制剂预处理双膜结构充填缺损。分别于术后2、4、8周取材,HE染色观察缺损修复情况,Real-time PCR方法检测I-κB、P-65和成软骨相关基因Aggrecan、Sox-9的表达水平,并进行统计分析。结果:C组新生髁突软骨组织中NF-κB各信号分子及成软骨相关基因的表达水平均明显高于相同时间取材的其他各组(P<0.05),其缺损修复的效果也最好;D组、E组各时间点的NF-κB信号通路相关信号分子及成软骨相关基因表达水平均明显低于A、B、C组(P<0.05)。结论:BMSCs/PRF双膜结构能明显促进髁突软骨缺损的修复,以压力预调的双膜结构修复效果尤为显著;NF-κB参与了体内压力促双膜结构合成软骨的过程。     

重组新疆出血热病毒S和M基因疫苗诱导小鼠免疫应答的评价

目的选取新疆出血热病毒M基因(编码糖蛋白Gn,Gc)和S基因(编码核蛋白NP)部分基因片段,并进行部分片段的嵌合,分别插入至真核表达载体PVAX1中构建重组质粒,并将重组质粒分别免疫小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答的效果。方法将NP(aa1~482)、NP2(aa170~305)和糖蛋白Gn(aa529~820)、Gc(aa1050~1697)片段,及Gc-NP2片段分别构建到真核表达载体PVAX1上构建重组质粒,用重组质粒免疫小鼠,通过T细胞增殖试验,细胞因子含量测定和ELISA对免疫效果进行评价。结果经双酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。pVAX1-NP2实验组小鼠的血清抗体效价可以达到1∶6 400,pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2实验组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显,两组的IFN-γ的表达水平也高达(865.15±6.29)pg/mL及(1727.21±33.93)pg/mL,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。pVAX1-NP2及pVAX1-Gn实验组IL-4的表达水平为(19.11±1.20)pg/mL和(20.07±1.67)pg/mL,都显著高于对照组的(9.35±1.82)pg/mL(P0.05)。结论成功构建了多个重组真核表达载体,免疫小鼠后获得了效价高,特异性好的抗体。各重组质粒都激起了较强的体液免疫及细胞免疫,pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2实验组效果最好,可将其作为新疆出血热病毒的候选疫苗。     

草原兔尾鼠卵透明带3(ZP3)cDNA保守序列的克隆与序列分析

根据Gene Bank数据库中5种啮齿目动物卵透明带3（ZP3)cDNA的序列,利用DNAMAN和NIH NCBI BLAST同源性分析程度设计了特异性引物。从6周龄的未孕雌性的草原兔尾鼠中用柱离心法得到总RNA,利用反转录技术得到cDNA,通过特异性引物进行PCR扩增草原兔尾鼠的ZP3cDNA保守序列。将扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆,酶切鉴定后进行测序。将其与Gene Bank中啮齿目动物ZP3 cDNA进行同源性比较,获得了草原兔尾鼠ZP3cDNA的保守基因序列,与啮齿类同类基因比较,具有较高的同源性。     

纳米羟基磷灰石及其复合材料的研究进展

纳米羟基磷灰石是自然骨的主要无机成分,但是由于其本身脆性大的特性,限制了其在骨组织修复中作用。因此纳米羟基磷灰石复合材料已成为当今骨修复材料的热点,本文综述了近几年来纳米羟基磷灰石和各种复合材料的性能特点及研究现状,对其发展提出了展望。     

HPV16E7E6抗原表位嵌合体DNA抗肿瘤疫苗的研究

目的:探讨HPV16 E7、E6抗原表位与HSP70 N端重组DNA疫苗抗肿瘤活性.方法:以重叠PCR将HPV16 E7基因N端60个氨基酸的编码序列与E6基因的10个(48～57)氨基酸的编码序列及HSP70 N端序列进行融合.以pcDNA3.0为载体,构建真核表达载体pcD-E76HSP.重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的治疗效果.结果:重组DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,并可诱导产生针对TC-1肿瘤细胞的特异性CTL反应;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应,显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.